白细胞介素-10通过乙二醛酶1影响脊髓钝挫伤大鼠运动功能的恢复

目的　用慢病毒介导的方法抑制白细胞介素-10（IL-10）的RNA,观察IL-10通过乙二醛酶1（GLO1）影响大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。 方法　SD大鼠66只,采用Allen’s法制备脊髓钝挫伤（spinal cord contusion,SCC）模型,随机分为Sham组（n=9）、SCC组（n=27）、Vector组（n=15）和IL-10 SH组（n=15）,分别注射空质粒和包装IL-10 siRNA的质粒;每组再分为3 d、7 d和28 d 亚组。采用BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）评分评估大鼠后肢运动功能;免疫组织化学和qRT-PCR技术定位和定量测定IL-10和GLO1的表达变化;用慢病毒包装的RNA构建IL-10的RNA干扰模型（IL-10-SH-LV）评估IL-10和GLO1在脊髓损伤后的功能,GeneMANIA生物信息学预测IL-10和GLO1的关系。 结果　SCC后大鼠双后肢截瘫,后肢运动功能消失,BBB评分在损伤后1 d,3 d,7 d,14 d逐渐恢复,但低于对照组。qRT-PCR结果显示IL-10在脊髓损伤后表达显著降低;SCC后,免疫组织化学结果显示IL-10主要在脊髓前角的神经元和神经胶质细胞中表达。慢病毒干扰IL-10的表达后,随着时间推移,GLO1表达增加,大鼠运动功能BBB评分也逐渐恢复。GeneMANIA结果显示GLO1和IL-10通过共表达的Hpd和Klk1c2、Kcns1、Proc相互作用。 结论　IL-10通过上调抗氧化应激因子GLO1的表达促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复。     

大鼠脊髓钝挫伤后IL-6在白质中的表达变化与运动功能联系

目的探讨白细胞介素-6(IL-6)在脊髓损伤SD大鼠白质中的定位及表达变化,分析IL-6对大鼠神经行为学变化的影响。方法 66只成年SD大鼠,随机分为假手术组和脊髓顿挫损伤(Spinal cord contusion,SCC)术后12h、3d、5d、7d、14d组。用BBB神经功能评分评价脊髓顿挫损伤后大鼠的运动功能;采用RT-qPCR技术检测IL-6mRNA含量变化;采用免疫组化染色,定位观察IL-6在脊髓白质中的分布。结果 SCC后大鼠后肢运动功能消失,BBB评分显示术后5d、7d、14d较Sham组明显降低(P0.05)。RT-qPCR表明IL-6mRNA在SCC后12h表达峰值,与假手术组相比差异有统计学意义(P0.05);IL-6mRNA在第5d明显下降,与12h相比较具有显著性差异(P0.05)。免疫组化结果显示:IL-6主要分布在脊髓白质区的小神经胶质细胞和神经纤维。结论 SCC后大鼠后肢运动功能障碍随时间推移而得到一定的改善,其机制可能与IL-6的表达减少相关,因此,脊髓白质中IL-6的表达与运动功能恢复有关。     

大鼠脊髓损伤对IL-10和原肌球蛋白4在脊髓中表达的影响

目的:探讨脊髓顿挫伤(spinal cord contusion,SCC)后白细胞介素10(IL-10)和原肌球蛋白4(TPM4)在脊髓中的表达变化。方法:成年健康雌性SD大鼠,随机分为假手术组(Sham)和脊髓顿挫伤组(SCC)。用Allen’s打击法建立脊髓顿挫损伤模型,BBB评分评价大鼠运动功能变化;免疫组织化学技术分别显示IL-10和TPM4在脊髓组织的定位情况;并利用q-PCR检测两者的mRNA含量变化。结果:BBB评分结果表明SCC组大鼠运动功能明显障碍,但损伤后7 d(P0.05)、14 d(P0.001)和28 d(P0.001)组逐渐得到改善。免疫组化结果显示,IL-10主要定位于脊髓白质神经胶质细胞的胞体和突起,第28 d在血管内皮细胞也有少量表达。TPM4主要定位于神经元和胶质细胞质和突起。q-PCR结果显示,大鼠术后IL-10 mRNA表达在第1d组明显增加(P0.001),而后逐渐下降到Sham组水平。TPM4 mRNA含量在损伤后第7 d(P0.05)明显降低,后又逐渐上升。结论:脊髓损伤早期,IL-10表达增高可抑制脊髓组织的炎症反应,从而减轻组织损伤。而脊髓损伤后期TPM4表达升高可能与神经元修复有关。     

神经节苷脂对急性脊髓损伤大鼠Caspase-3表达的影响

目的研究单唾液酸神经节苷脂(GM1)对急性脊髓损伤大鼠Caspase-3表达的变化。方法选取72只成年健康SD大鼠,按Nystrom法建立大鼠脊髓损伤模型,按随机数字表法分为假手术组、脊髓损伤组和M1组,每组各24只,脊髓损伤组和GM1治疗组依据脊髓损伤后的不同时间点再细分为1、7和14 d三个亚组。伤后第1、7和14天分别用BBB评分和斜板试验观察大鼠运动功能的恢复情况。免疫组化方法和Western blot方法检测三组大鼠脊髓损伤部位Caspase-3的表达。结果术后7和14 d,GM1治疗组BBB评分和斜板试验明显优于脊髓损伤组,差异有统计学意义(P0.05)。免疫组化检测发现假手术组大鼠脊髓仅有少量Caspase-3阳性表达细胞;在脊髓损伤后1 d时,Caspase-3阳性细胞数明显增多,7 d表达开始减弱(P0.05)。与相同时间点的SCI组比较,GM1组大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3阳性细胞明显减少(P0.05)。Western blot结果与免疫组化结果一致。结论下调Caspase-3蛋白的表达可能是GM1治疗急性脊髓损伤的机制之一。     

低剂量脂多糖预处理上调Nrf2表达减轻大鼠脊髓损伤的炎症反应

目的探讨低剂量脂多糖预处理对大鼠脊髓损伤的神经保护作用及其可能机制。方法 48只雌性SD大鼠随机分为4组:空病毒(EV)组、脂多糖联合空病毒(LPS-EV)组、核因子E2相关因子2(Nrf2)干扰病毒(NIV)组、脂多糖联合Nrf2干扰病毒(LPS-NIV)组,每组各12只。采用改良Allen’s打击法建立创伤性脊髓损伤(TSCI)模型,术后3 d进行BBB后肢运动神经功能评分,获取脊髓损伤段组织标本,HE染色观察其组织病理变化;Nissl染色观察神经元中Nissl体变化及神经元生存指数;免疫组织化学染色及Western blot法检测Nrf2、核因子κB(NF-κB)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达变化。结果与EV组比较,NIV组脊髓组织Nrf2蛋白表达降低,NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白表达增高,与LPS-NIV组比较无显著性差异;与EV组、LPS-NIV组比较,LPS-EV组Nrf2蛋白表达上调,NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白表达降低,神经元生存指数明显提高,脊髓组织病理损伤明显改善;各组之间BBB评分无统计学差异。结论低剂量LPS预处理对大鼠脊髓损伤起神经保护作用,其机制是通过介导Nrf2的表达,下调NF-κB及促炎症因子水平,从而减轻炎症反应。     

LPS预处理通过Nrf2介导对脊髓损伤的保护作用

目的:探讨大鼠经低剂量脂多糖预处理对脊髓损伤的神经保护作用及可能机制。方法:120只雌性SD大鼠随机分为空病毒(EV)组、LPS+空病毒(LPS+EV)组、Nrf2干扰病毒(NIV)组、LPS+Nrf2干扰病毒(LPS+NIV)组,每组分别30只。采用改良Allen's打击法制备创伤性脊髓损伤(Traumatic spinal cord injury,TSCI)模型,于术后1、3、7、14、28 d进行大鼠双后肢BBB(Basso Beattie and Bresnahan)评分。获取脊髓损伤段组织标本,HE染色观察其组织病理变化;Nissl染色观察神经元中尼氏小体变化及神经元生存指数;免疫组化及Western blot检测Nrf2、GCLC蛋白的表达变化。结果:术后7、14、28 d,LPS+EV组BBB评分显著高于EV组(P0.05,P0.01);NIV组与LPS+NIV组之间评分无统计学差异(P0.05)。与EV组比较:1~7 d时,LPS+EV组Nrf2蛋白表达显著增高(P0.05,P0.01),Nissl染色显示神经元生存指数显著升高(P0.05,P0.01);1~14 d,LPS+EV组GCLC蛋白表达明显增加(P0.05),HE染色显示其脊髓损伤组织病理结构明显改善。结论:低剂量脂多糖预处理能够促进大鼠创伤性脊髓损伤的神经功能恢复,其机制可能是通过激活Nrf2介导抗氧化应激通路来实现的。     

N-乙酰半胱氨酸对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响及可能机制

目的观察N-乙酰半胱氨酸对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响,并探讨其可能的作用机制。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠60只,随机分为N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)治疗(NAC组)、单纯脊髓损伤组(SCI组)和假手术组(Sham组),每组20只。采用Allen法损伤大鼠T9脊髓节段,制备大鼠脊髓损伤动物模型。造模成功后15 min,NAC组腹腔注射NAC 150 mg/kg,每日1次,共7次;SCI组和Sham组腹腔注射等体积的生理盐水。于术后1 d、3 d、7d、14d随机抽取各组动物5只,进行后肢功能BBB评分、ELISA检测脊髓组织中炎症因子IL-1β和IL-18水平,Western blot检测脊髓组织中Caspase1蛋白表达水平。结果与Sham组比较,SCI组术后各时间点BBB评分均显著降低,脊髓组织中炎症因子IL-18和IL-1β水平均显著升高,Caspase1蛋白表达水平显著升高(0.05)。与SCI组比较,NAC组术后3d、7d、14d BBB评分均显著升高,脊髓组织中IL-18和IL-1β水平显著降低,Caspase1表达水平显著降低(0.05)。结论 NAC促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复可能与抑制Caspase1表达降低炎症因子IL-1β和IL-18水平相关。     

LY-294002对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3表达的影响

目的研究LY-294002对急性脊髓损伤大鼠Caspase-3表达的变化。方法选取104只成年健康SD大鼠,按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8～9)急性压迫损伤模型,按随机数字表法分为假手术组8只、损伤组48只、LY-294002组48只。免疫组化和Western blot方法检测各组大鼠脊髓损伤部位Caspase-3的表达。结果免疫组化结果发现假手术组大鼠脊髓神经细胞中Caspase-3阳性细胞较少;在脊髓损伤后8 h时,Caspase-3阳性细胞数明显增多,3 d达高峰,7 d表达开始减弱。在经LY-294002处理后的各时间点大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3阳性细胞明显少于相同时间点的脊髓损伤组大鼠。Western blot方法发现假手术组大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3的表达量很少,而在脊髓损伤后8h时,Caspase-3蛋白表达量明显增多,3 d达高峰,7 d表达开始减弱,在经LY-294002处理后的各时间点大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3蛋白表达则明显少于相同时间点的脊髓损伤组大鼠,与免疫组化结果一致。结论LY-294002能够下调急性脊髓损伤大鼠Caspase-3蛋白的表达。     

大鼠脊髓钝挫伤后单核细胞趋化蛋白-1与趋化因子受体2的表达变化

目的:探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和趋化因子受体2(CCR2)在脊髓钝挫伤(SCC)大鼠的表达及其对运动功能和感觉功能的影响。方法:SD大鼠随机分为损伤(SCC组)术后12h、3d、7d、14d组及假手术组共5组。Allen打击法建立SCC模型,进行BBB评分,光热尾痛法测定大鼠温痛觉潜伏期,RT-PCR检测CCR2和MCP-1基因相对表达量,免疫组织化学观察MCP-1和CCR2在脊髓前角和后角的表达。结果:SCC后BBB评分降低,7d与14dBBB评分明显增高。SCC后3、7d温痛觉潜伏期较假手术组缩短。SCC后CCR2mRNA在12h和3d时表达量增高;随后在7、14dCCR2mRNA降低。MCP-1mRNA的表达量在12h、3d、7d增高,14dMCP-1mRNA下降。MCP-1和CCR2在脊髓前角主要表达在神经元中,在脊髓后角主要表达于神经胶质细胞和神经元。结论:MCP-1和CCR2可能作为重要的因子参与脊髓损伤早期的继发性损伤,导致大鼠运动功能和感觉功能障碍。     

依达拉奉联合甲强龙对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

目的探讨依达拉奉与甲强龙联合应用对大鼠急性脊髓损伤神经组织的保护作用。方法选取120只成年SD大鼠,随机分为5组(每组24只):假手术组、急性脊髓损伤组、依达拉奉治疗组(0.3mg/100g)、甲强龙治疗组(3mg/100g)和联合治疗组(依达拉奉0.3mg/100g+甲强龙1.5mg/100g)。采用改良Allen法制作大鼠T10节段急性脊髓损伤模型。应用后肢运动学评分标准(BBB评分)分别于术后1、2、7和14d对各组大鼠进行评分;采用TUNEL法检测各组脊髓损伤组织中神经细胞凋亡率的变化,Western blot法检测各组脊髓损伤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平变化。结果药物治疗各组大鼠的BBB评分均明显高于脊髓损伤组,且脊髓损伤组织中神经细胞的凋亡率以及Bax和Caspase-3的蛋白表达水平均显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平显著增高(P0.05);联合治疗组大鼠的BBB评分明显高于依达拉奉或甲强龙单独治疗组,且脊髓损伤组织中神经细胞的凋亡率以及Bax和Caspase-3的蛋白表达水平均显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平显著增高(P0.05)。结论依达拉奉联合甲强龙抑制大鼠急性脊髓损伤后神经细胞发生凋亡,发挥神经保护作用,同时能够减少甲强龙的使用剂量。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域（gAd）基因。方法以人基因组为模板,PCR法扩增人gad基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac。筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid—gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果显示,BacmidgAd组和对照组相比．在相对分子质量15000～25000之间多出一清晰的蛋白条带．免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合。结论人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础。     

TGF—αT —Ⅱ在乳腺癌患者围手术期的表达

胰岛素样生长因子(IGF-Ⅱ)和转化生长因子(TGF-α)是具有广泛生物学活性的多肽类生长因子,但在正常组织及肿瘤组织中的表达如何,研究报道不一。本文测定了乳腺癌患者血液、尿液及肿瘤组织IGF-Ⅱ和TGF-α水平,旨在探讨其在乳腺癌患者围手术期的表达及生物学意义。1材料和方法1.1研究对象21例女性,年龄40～71岁,均系本院手术后经病理诊断证实的乳腺癌患者。其中浸润型导管癌14例,乳腺髓样癌3例,乳腺低分化腺癌2例,导管浸润癌伴腺癌2例;正常对照组:30例,为我院查体健康的女性,年龄38～55岁。1.2标本采集及检测方法采集乳腺癌患者手术前血…     

小鼠轻度病毒性心肌炎急性期心肌组织MHCⅡ类抗原的表达

为研究小鼠急性病毒性心肌炎心肌MHCⅡ类抗原的表达规律,探索急性期轻度病毒性心肌炎的发病机制,以适量柯萨奇B3病毒感染BALB／c小鼠制成小鼠病毒性心肌炎模型,对病鼠的心肌进行MHCⅡ类抗原表达强度的半定量记分（MS）与心肌病变积分（PS）无相关。实验提示,心肌MHCⅡ类抗原的异常表达是轻度病毒性心肌炎急性期的发病机制之一：自身免疫反应在病毒性心肌炎急性期与心肌病变的严重程度无相关。     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体（FcεRⅡ）基因的原核表达系统。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FcεRⅡcDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体FcεRⅡ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FcεRⅡ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FcεRⅡ的表达。结果测序表明所扩增FcεRⅡcDNA基因,与已报道的序列一致。获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合。结论成功构建了FcεRⅡ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人IgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FcεRⅡ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础。     

pHsa—m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的构建肝脏特异性的微RNA—miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定。方法经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA—miR-122的前体序列，引入酶切位点和Poly T转录终止序列，将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中。将构建载体进行酶切、测序鉴定，再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后．经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测，鉴定载体功能性表达。结果miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上，且可表达出具有生物活性的miR-122，将该真核表达载体命名为pHsa-m122。结论成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122，有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用。