Caspase-3在微囊藻毒素-LR诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡中的作用

目的研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)染毒对大鼠睾丸支持细胞凋亡形态以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活力的改变。方法自健康18～20日龄SPF级SD雄性大鼠体内分离、培养睾丸支持细胞。用含MC-LR终浓度分别为0(对照)、1、10μg/ml的培养液培养48 h。采用Hoechst荧光染色法检测睾丸支持细胞的凋亡情况;采用caspase-3底物切除法检测caspase-3的活力。结果随着MC-LR染毒剂量的增高,大鼠睾丸支持细胞凋亡率升高。与对照组比较,仅10μg/ml MC-LR染毒的睾丸支持细胞caspase-3活力升高,差异有统计学意义(P<0.05);而1μg/ml MC-LR染毒睾丸支持细胞caspase-3活力略有降低,但差异无统计学意义。结论 MC-LR能诱导睾丸支持细胞发生凋亡,caspase-3在MC-LR诱导睾丸支持细胞凋亡中起重要调控作用。     

活性氧在氯化镉诱导的小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用

目的 探究活性氧(reactive oxygen species, ROS)在氯化镉(cadmium chloride, CdCl₂)诱导的睾丸间质细胞毒性中的潜在作用及机制。方法 以不同浓度CdCl₂(0、5和10μmol/L)染毒小鼠睾丸间质TM3细胞24 h。CCK-8法检测CdCl₂对TM3细胞活性的影响;Hoechst33342染色法检测凋亡小体;DCFH-DA探针法检测TM3细胞ROS水平;1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)预处理1 h后用10μmol/L CdCl₂染毒TM3细胞24 h, Western blot检测细胞内促凋亡蛋白Caspase-9和cleaved Caspase-3的表达水平;RT-qPCR检测细胞内抗凋亡基因Bcl-2以及促凋亡基因Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平。结果 CdCl₂染毒细胞24 h后,TM3细胞活力降低且凋亡小体数量增加。10μmol/L CdCl<...     

微囊藻毒素-LR对体外培养大鼠睾丸支持细胞中活性氧及丙二醛含量的影响

目的研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)对大鼠睾丸支持细胞中活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量的影响。方法分离并培养10只健康18～20日龄清洁级雄性SD大鼠睾丸支持细胞。调整细胞密度为1×104～2×104个/ml,在终浓度分别为0(溶剂对照)、0.15、1.5、15μg/L的MC-LR培养液中染毒24h,采用MMT法测定细胞活性。调整细胞密度为2×105～4×105个/ml,在终浓度分别为0(溶剂对照)、0.15、1.5、15μg/L的MC-LR培养液中染毒6、12、24h,检测睾丸支持细胞中ROS和MDA含量。结果与溶剂对照组相比,染毒24h后各MC-LR染毒组细胞活性均有所增加,但差异均无统计学意义。与溶剂对照组比较,染毒6、24h时15μg/LMC-LR染毒组睾丸支持细胞ROS含量较高,差异均有统计学意义(P0.05)。且随着MC-LR染毒剂量的增加和染毒时间的延长,睾丸支持细胞ROS含量呈上升趋势。不同染毒时间各染毒组睾丸支持细胞中MDA含量与溶剂组相比,差异无统计学意义。结论睾丸支持细胞暴露于本实验剂量MC-LR时可引起细胞中ROS含量升高,但不引起睾丸支持细胞MDA含量的改变。     

活性氧在微囊藻毒素-LR诱导细胞凋亡效应中的作用探讨

[目的]研究微囊藻毒素．LR（MC—LR）对原代大鼠肝脏细胞的促凋亡效应以及探讨活性氧（ROS）在这一效应中的作用。[方法]采用胶原酶灌注法获取原代大鼠肝脏细胞,用William’s E培养液重悬后接种于铺被鼠尾胶原的孔板内,分为1个对照组和4个染毒组,370C、5％CO2条件下培养3h后换液并染毒各梯度浓度的MC—LR,使各染毒组毒物终浓度分别为1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol／L。染毒相应时间后,采用中性红比色实验检测细胞存活率,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS含量。[结果]中性红比色实验发现,至染毒期末观察到1×10^-5、1×10^-6mol／L两个染毒组的肝脏细胞几乎全部死亡（〉95％）,1×10^-7mol／L染毒组部分肝脏细胞死亡（约30％）;流式细胞术观察到MC—LR染毒后早期（5min）诱导细胞调亡,同时观察到肝脏细胞内短时间（15min）快速产生大量的ROS。[结论]MC—LR诱导原代大鼠肝脏细胞快速产生大量的ROS,这可能是MC-LR诱导细胞凋亡并最终导致细胞死亡的毒性作用机制之一。     

微囊藻毒素对大鼠睾丸支持细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的 利用体外培养的大鼠睾丸支持细胞研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)对细胞中凋亡相关蛋白表达水平的影响.方法 大鼠睾丸细胞分别染毒0(对照)、0.5、1、10、20 μg/ml MC-LR溶液后培养24和48 h,采用MTT法检测细胞活性.调整细胞密度为4×106～5×106/ml,分别染毒含0(对照)、1、10 μ...     

活性氧在氯化锰致PC12细胞凋亡中的作用

目的 探讨活性氧（ROS）在氯化锰（MnCl2）诱导PC12细胞凋亡中的作用机制.方法 构建MnCl2诱导的PC12细胞模型,MTT法检测细胞存活率,流式细胞分析PC12细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化程度;分光光度法检测培养基中活性氧（ROS）生成量变化;化学发光法检测细胞三磷酸腺苷（ATP）生成量和Caspase-3表达量的变化;RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-xl和bax的表达.结果 PC12细胞存活率与MnCl2诱导浓度和诱导时间呈负相关（P＜0.01）;2 mmol/L MnCl2诱导PC12细胞36 h,细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）;核DNA发生明显片段化;细胞ROS生成量明显增加（P＜0.001）,细胞ATP生成量受到明显抑制（P＜0.01）;基因bcl-xl表达被抑制,bax表达上升（P＜0.01）;Caspase-3在细胞凋亡中被激活（P＜0.01）.结论 MnCl2诱导的PC12细胞凋亡与ROS升高、线粒体功能破坏和激活Caspase-3有关.     

p,p’-DDE对大鼠睾丸支持细胞抑制素B表达的影响

目的研究p,p’-DDE对离体培养的大鼠睾丸支持细胞细胞内抑制素B的影响。方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养,在细胞毒性试验的基础上确定受试物的剂量,以RT-PCR方法定量抑制素B在不同剂量受试物作用下的变化情况。结果p,p’-DDE中、高浓度组与溶剂对照组和低浓度组比较差异均有显著性(P<0.05)。抑制素B的灰度值随着p,p’-DDE浓度的增高逐渐降低,呈剂量依赖关系。结论p,p’-DDE对大鼠睾丸支持细胞分泌抑制素B表达可能存在着抑制作用。     

活性氧、线粒体膜电位在亚砷酸钠诱导凋亡中作用

有研究表明,砷可以引起机体内砷致机体脂质过氧化的产生及抗氧化能力降低,从而造成机体的氧化损伤^(1-2)。而肝脏是砷主要累及的靶组织⁽³⁾,但砷对肝细胞的作用特点研究较少。研究提示,活性氧(ROS)和线粒体膜电位(ΔΨm)在细胞凋亡中发挥着重要作用^(4-5)。为了进一步探讨砷对肝细胞的凋亡作用机制,本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡率和胞浆中ROS、ΔΨm水平,并探讨ROS和ΔΨm在NaAsO₂诱导L-02肝细胞凋亡过程中的作用。     

壬基酚对体外培养大鼠睾丸支持细胞凋亡影响的研究

目的探讨壬基酚对大鼠睾丸支持细胞的影响及其作用机制.方法建立体外培养大鼠睾丸支持细胞以及混合培养支持细胞和生精细胞体系,以不同浓度的壬基酚(分别为0.2μg/L、1.0 μg/L、3.0 μg/L、5.0 μg/L)作用于支持细胞和混合培养的支持细胞和生精细胞,采用MTT法测定支持细胞的活性,流式细胞仪测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法测定混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量的变化.结果随着壬基酚作用剂量的增大和作用时间的延长支持细胞的活性下降,且支持细胞的凋亡率随着壬基酚浓度的增大而提高;混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量均明显提高.结论壬基酚可引起支持细胞凋亡,进而通过Fas/FasL系统启动生精细胞凋亡.     

山楂黄酮对微波辐射大鼠睾丸细胞凋亡的防护作用

目的探讨山楂黄酮对微波辐射所致大鼠睾丸细胞凋亡的防护作用。方法将40只Wistar雄性大鼠随机分为5组,每组8只,分别为空白对照组、辐射模型组、低剂量防护组[40 mg/(kg·d)]、中剂量防护组[(60 mg·(kg·d)]和高剂量防护组[(80 mg/(kg·d)]。辐射模型组和各剂量防护组大鼠均给予200 m W/cm2微波辐射6 min;各防护组按上述剂量再给予山楂黄酮灌胃,每日1次,连续7 d。7 d后处死大鼠,观察睾丸细胞形态学变化,检测细胞存活率、凋亡率及caspase-3活力。结果微波辐射后,辐射模型组大鼠曲精小管退化坏死,胞浆结构疏松,内有水肿空泡,细胞器稀少,胞体核固缩,染色质边集;细胞存活率低于空白对照组,细胞凋亡率和细胞中caspase-3活力高于对照组,差异均有统计学意义(P0.01)。山楂黄酮灌胃后,低剂量和中剂量防护组大鼠的睾丸组织形态学变化与辐射模型组相似,而高剂量防护组细胞损伤较轻;各剂量防护组细胞存活率高于辐射模型组,细胞凋亡率和细胞中caspase-3活力低于辐射模型组,差异均有统计学意义(P0.01)。结论 200 W/cm2微波辐射可使大鼠睾丸细胞凋亡,山楂黄酮对微波辐射引起的睾丸细胞凋亡有一定防护效果。     

p,p'-DDE对离体培养的大鼠睾丸支持细胞内钙离子的影响

目的 研究p,p'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)细胞内钙离子的影响.方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞并进行离体原代培养,设空白对照组、溶剂对照组和低、中、高剂量p,p'-DDE染毒组(10、30、50 μmol/L),然后以Fura-2/AM为钙探针,用细胞内双波长钙荧光系统通过测定荧光值计算细胞内钙离子浓度的变化.结果 高剂量组支持细胞中Ca2+浓度高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 p,p'-DDE可干扰支持细胞内钙离子稳态,造成钙的超负载.钙离子稳态失衡可能诱导支持细胞凋亡,最终可能导致生殖功能障碍.     

p,p'-DDE对青春前期大鼠睾丸组织氧化应激及凋亡的影响

目的 研究p,p'-DDE对青春前期大鼠睾丸组织氧化应激及凋亡的影响.方法 将健康清洁级22日龄雄性SD大鼠25只按体重随机分为5组,分别为对照组(玉米油)、低(20 ms/kg)、中(60 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量P,p'-DDE染毒组和VitE干预组(100mg/kg p,p'-DDE+100mg/kg Vit E),每组5只.采用腹腔注射方式进行染毒,注射容积为10ml/kg,每隔1 d染毒1次,共10 d.染毒结束后,处死动物,取睾丸称重,并计算睾丸脏器系数;将睾丸制备组织切片和组织匀浆,分光光度计法测定大鼠睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,采用TUNEL法检测睾丸组织的细胞凋亡情况.结果 各组动物染毒前体重及染毒期间体重变化无差异.大鼠睾丸重量及其脏器系数间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,高、中、低剂量p,p'-DDE染毒组SOD活力降低,中、高剂量p,p'-DDE染毒组MDA含量升高,高剂量p,p'-DDE染毒组GSH-Px活力下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).与高剂量p,p'-DDE染毒组比较,Vit E干预组SOD活力升高,差异有统计学意义(P＜0.05).Vit E干预组和高剂量p,p'-DDE染毒组MDA含量和GSH-Px活力间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).高、中、低剂量p,p'-DDE染毒组和对照组均有睾丸细胞凋亡情况发生,对照组中凋亡细胞稀少;随着p,p'-DDE染毒剂量的升高,凋亡细胞数也逐渐增多,以精原细胞和精母细胞为主,伴有支持细胞.与对照组比较,高、中、低剂量P,p'-DDE染毒组的细胞凋亡指数均升高,差异有统计学意义(P＜0.05);Vit E干预组的细胞凋亡指数低于高剂量p,p'-DDE染毒组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 p,p'-DDE可通过引发睾丸组织氧化应激而诱导细胞凋亡.     

p,p'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞转铁蛋白表达的影响

目的研究P,P'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞转铁蛋白表达的影响.方法对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养,运用一步法RT-PCR检测给与P,P'-DDE后24 h支持细胞转铁蛋白mRNA水平.结果睾丸支持细胞转铁蛋白mRNA水平随P,P'-DDE所给剂量的增高而降低,且与对照组差异存在显著性(P＜0.05),呈剂量依赖关系.结论P,P'-DDE 可抑制睾丸支持细胞转铁蛋白的基因转录,从而抑制其合成,导致精子发生障碍和生殖功能紊乱.     

软骨藻酸诱导PC12细胞凋亡及对活性氧的影响

[目的]研究软骨藻酸诱导PC12细胞凋亡及对活性氧的影响. [方法]流武细胞仪法测定0、0.01、0.1、l μmol/L软骨藻酸作用PCI2细胞24h后,对细胞凋亡、细胞周期和活性氧生成的影响. [结果]软骨藻酸可诱导PC12细胞凋亡的发生,与对照组(凋亡率为0.250±0.053)相比,所有染毒浓度组PCI2细胞凋亡率均上升且差异有统计学意义;并将PC12细胞阻滞于细胞周期中的G2/M期,0.1、1 μmol/L组中处于G2/M期的PC12细胞数量与对照组相比,差异具有统计学意义;所有浓度组均可使PC12细胞的活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)平均荧光强度增加(0.01 μmnol/L组为187.140±3.629,0.1 μmol/L组为206.023±5.277,1 μmol/L组为348.915±3.343),与对照组(163.660±4.059)相比,差异均具有统计学意义.[结论] 软骨藻酸能诱导PC12细胞凋亡的发生,将PC12细胞阻滞于细胞周期中的G2/M期,并使得细胞内的ROS产生增加.     

P,P''''-DDE对睾丸支持细胞雄激素结合蛋白表达的影响

[目的]研究雄激素结合蛋白在P,P'-DDE致雄性大鼠生殖内分泌干扰过程中的作用机制。[方法]对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养4-5 d;设溶剂(DMSO)及阴性对照,以终浓度为30、50、80、100 μmol／L的P,P'-DDE作用于支持细胞24h,计数200个细胞,计算支持细胞存活率;分别以浓度为10、30、50 μmol/LP,P’-DDE作用于支持细胞24h, 运用一步法RT-PCR检测支持细胞内雄激素结合蛋白基因mRNA水平。[结果]P,P'-DDE在50μmol／L及以下浓度作用 24 h后,支持细胞存活率>90％,而80μmol/L组仅45％;染毒24 h后,对照组及10、30、50 μmol/L的P,P’-DDE组支持细胞内雄激素结合蛋白mRNA灰度比值分别为0．3140±0．1020、0．3920±0．0949、0．5837±0．1221、0．6490±0．1718,随 p,p'-DDE所给浓度的增高而逐渐升高,且30、50 μmol/L组与对照组差异存在显著性(P<0．05),呈剂量依赖关系。[结论] p,p'-DDE作用于睾丸支持细胞后,雄激素结合蛋白基因转录水平可明显升高,从而表达增强,促进雄激素结合蛋白的生成,代偿性地维持生精过程。     

p，p＇-DDE、β-BHC对大鼠支持细胞FasL mRNA表达及NF-κB活性的影响

[目的]研究有机氯农药DDT和六六六的代谢产物（p，p＇-DDE）和β-BHC及联合染毒对离体培养大鼠支持细胞（sertoli cell）FasL mRNA表达及NF—κB活性的影响。[方法]分离大鼠睾丸支持细胞进行原代培养2d，以DMSO为溶剂对照，分别以终浓度为10、30、50μmol／L的p，p＇-DDE、β-BHC及联合染毒支持细胞24h，应用RT-PCR法研究支持细胞FasL mRNA的表达；用激光共聚焦显微镜检测NF—κB的转位激活状况。[结果]10、30、50μmol／L的p，p＇-DDE、β-BHC及其联合染毒支持细胞后，FasL mRNA表达升高，50μmol／L剂量组与对照组差异有统计学意义（P〈0．05），各组内低、中剂量组与高剂量组差异有统计学意义（P〈0．05）；NF-κB活性明显增强。[结论]支持细胞经p，p＇-DDE、β-BHC及其联合染毒后，FasL mRNA表达明显升高，NF—κB的活性随染毒剂量的增加而增强，且联合作用比单独作用更加明显。     

六氯联苯诱导新生雄性大鼠睾丸细胞凋亡的体内体外研究

[目的]观察2,2’,4,4’,5,5’-六氯联苯（PCB153）对新生SD大鼠睾丸细胞凋亡的影响。[方法]体内实验：一将出生3d（postnatal day3,PND3）的sD大鼠随机分组,每组24只,经口给予溶剂对照（玉米油）和PCB153（0．02500．250、2．500mg／ks）,连续暴露5d。最后一次暴露24h后解剖每组一半的动物,取睾丸组织做成切片,原位末端凋亡法（TUNEL法）检测睾丸细胞凋亡水平并电镜观察细胞形态;剩余动物在无暴露条件下继续喂养至12周龄（成鼠）解剖,进行精子计数。体外实验：新生大鼠（postnatal day5,PND5）睾丸组织分离精原一支持细胞共培养48h后,用0、1、10．50μmol／L的PCB153染毒24h,染色观察细胞核凋亡,流式细胞仪测定细胞早期凋亡率和晚期凋亡率O[结果]新生期大鼠不同。剂量PCB153暴露后,与对照组相比,0．250mg／kg和2．500mg／kg剂量组12周龄睾丸每日精子生成量明显下降（P〈0．05）。PND8时,TUNEL法检测发现PCB153染毒组大鼠睾丸中凋亡细胞各组间差异无统计学意义。电镜下观察曲细精蕾,可见染毒组支持细胞线粒体肿胀,生殖细胞核固缩凝结。体外共培养细胞染毒24h后,流式细胞仪检测发现,与对照组比较,50μmol／L组早期细胞凋亡率明显升高（P〈0．05）;但晚期凋亡率各组差异无统计学意义。荧光显微镜下观察,从PCB153染毒浓度10μmol／L起可见明显的凋亡细胞核形态特征。[结论]新生期大鼠暴露PCB153可直接诱导睾丸细胞凋亡,引起雄性大鼠生殖功能的远期损害。     

以支持细胞为饲养层培养冻存后大鼠精原干细胞研究

目的：研究冻存的精原干细胞体外分离培养的生物学特性,为今后冻存精原干细胞的批量培养和长期利用提供依据。方法：取7～8d的sD雄性大鼠,分离睾丸组织,用两步酶消化法和差速时间贴壁法,分离精原干细胞和支持细胞。以二甲基亚砜（DMSO）作冷冻保护液,将分离到的精原干细胞放置于液氮中冻存;利用体外培养体系,进行支持细胞的培养和饲养层的制备;然后将复苏的精原干细胞接种到支持细胞饲养层上培养,并利用碱性磷酸酶鉴定精原干细胞。结果：用两步酶消化法和差速贴壁法能分离到纯度较高的精原干细胞和支持细胞,冻存的SSCs解冻后能在支持细胞饲养层上贴壁、生长、增殖,碱性磷酸酶活性鉴定呈阳性。结论：冻存后精原干细胞在体外支持细胞饲养层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞提供细胞模型。     

Piperlongumine Induces Apoptosis in Human Melanoma Cells Via Reactive Oxygen Species Mediated Mitochondria Disruption

Malignant melanoma is a devastating skin cancer due to its severe drug resistance and prompt metastasis. Piperlongumine is an anti-inflammation and tumor-suppressing natural product with defined structure. While numerous studies revealed exceptional inhibitory effects of piperlongumine on several carcinomas, few investigations were performed on melanoma. Therefore, the present study investigated the anti-tumor effects of piperlongumine on human melanoma cells in vitro, and explored the mechanisms of action. Results from cytotoxicity and proliferation studies demonstrated that piperlongumine inhibited cell growth in melanoma cell lines A375, A875, and B16-F10 in a dose- and time-dependent manner. Flow cytometric analysis showed that piperlongumine obstructed cell cycle progression at G2/M phase and induced apoptosis in A375 cells. Mechanistic investigations illustrated that piperlongumine promoted reactive oxygen species production and decreased mitochondrial membrane potential. In addition, piperlongumine was reported to interfere with the expression of p21, p27, cleaved caspases-3, Bax, Bcl-2, and p-Jun N-terminal kinase (JNK), which are typical regulators associated with cell proliferation, intrinsic apoptosis, and JNKs pathway. Taken together, these results strongly suggested that piperlongumine inhibits cell growth and induces apoptosis in human melanoma cells via ROS mediated mitochondria disruption and JNKs pathway, and piperlongumine may exert promising potential for patients suffering from malignant melanoma.     

Differential Effect of Grape Seed Extract against Human Non-small-Cell Lung Cancer Cells: The Role of Reactive Oxygen Species and Apoptosis Induction

The present study examines grape seed extract (GSE) efficacy against a series of non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines that differ in their Kras and p53 status to establish GSE potential as a cytotoxic agent against a wide range of lung cancer cells. GSE suppressed growth and induced apoptotic death in NSCLC cells irrespective of their k-Ras status, with more sensitivity toward H460 and H322 (wt k-Ras) than A549 and H1299 cells (mutated k-Ras). Mechanistic studies in A549 and H460 cells, selected, based on comparative efficacy of GSE at higher and lower doses, respectively, showed that apoptotic death involves cytochrome c release associated caspases 9 and 3 activation, and poly (ADP-ribosyl) polymerase cleavage, strong phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2, downregulation of cell survival proteins, and upregulated proapoptotic Bak expression. Importantly, GSE treatment caused a strong superoxide radical-associated oxidative stress, significantly decreased intracellular reduced glutathione levels, suggesting, for the first time, the involvement of GSE-caused oxidative stress in its apoptotic inducing activity in these cells. Because GSE is a widely-consumed dietary agent with no known untoward effects, our results support future studies to establish GSE efficacy and usefulness against NSCLC control.