幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据.方法:利用 PCR 技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp.经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%.结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础.     

幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性.方法 PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果 PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的 基因.重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论 成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白.     

幽门螺杆菌omp11基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体的构建与表达

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)外膜蛋白基因(omp11)与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,为幽门螺杆菌疫苗和诊断抗原的筛选奠定基础。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA,用自行设计的PCR引物,从染色体DNA上扩增出omp11基因,将其克隆到表达载体pMAL-c2x中,用重组质粒转化大肠杆菌(E．coli TB1)。对重组质粒进行酶切鉴定,对目的基因片段进行测序。用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果：用PCR方法扩增的omp11基因长度为561bp;经酶切鉴定和测序,插入到载体的基因片段与文献报道相一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为28000,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的30％。结论：作者构建的pMAL-c2x与omp11基因重组质粒在E．coli TB1中能够高效表达目的基因,该重组质粒的构建为H．pylori omp11基因的研究建立了重要的基础。     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

YPO1668融合基因原核表达系统的构建与鉴定

目的 构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)YP01668的重组蛋白,为鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供依据.方法 用经典PCR方法扩增,ypo1668基因,通过双酶切、连接反应,将目的 基因片段定向插入到表达载体pET-32a(+)上,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的 基因表达并纯化该目的 蛋白,通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析后,经Western Blot分析其免疫原性.结果 双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的 基因ypo1668已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为64.95kDa,融合蛋白的可溶部分较大.Western-blot结果显示重组YPO1668可与鼠疫诊断血清发生特异性反应.结论 成功克隆构建了pET32a-YPO1668融合基因原核表达系统,该融合蛋白具有较好的可溶性及免疫原性,成为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的优良备选抗原.     

YP01668融合基因原核表达系统的构建与鉴定

目的 构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)YP01668的重组蛋白,为鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供依据.方法 用经典PCR方法扩增,ypo1668基因,通过双酶切、连接反应,将目的 基因片段定向插入到表达载体pET-32a(+)上,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的 基因表达并纯化该目的 蛋白,通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析后,经Western Blot分析其免疫原性.结果 双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的 基因ypo1668已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为64.95kDa,融合蛋白的可溶部分较大.Western-blot结果显示重组YPO1668可与鼠疫诊断血清发生特异性反应.结论 成功克隆构建了pET32a-YPO1668融合基因原核表达系统,该融合蛋白具有较好的可溶性及免疫原性,成为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的优良备选抗原.     

创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定

目的:构建创伤弧菌溶血素基因(vvs)的融合表达载体,并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达.方法:用一对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA中钓取眦基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET-32a( )-vvc融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物行SDS-PAGE并进行West-ern Blot鉴定.结果:构建了pET-32a( )-vvc融合表达载体,DNA测序证明,获得的vvc基因长度为1311 bp,与Gen-Bank中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致.SDS-PAGE分析表明,vvc融合蛋白Mr为71×103,其表达量约占菌体总蛋白的32%.Western blot结果显示,目的蛋白可与创伤弧菌免疫后的小鼠血清特异性结合.结论:成功地实现了VVC基因在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究僦蛋白的生物学功能奠定基础.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b( ),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。     

结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆及表达

目的构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达.方法采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37Rv ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达.目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究.结果构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30%;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90%;目的蛋白具有ICL的活性.结论利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础.     

恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体,为表达该基因奠定基础。方法:以恙虫病东方体Karp株基因组为模板,通过PCR方法扩增Sta22抗原基因,并将其克隆到表达载体pEASY-E2上,通过PCR方法及核苷酸测序进行鉴定。结果:所构建的原核表达载体携带Sta22基因,基因序列与GenBank上所公布的信息完全一致。结论:成功构建了Sta22抗原基因的原核表达载体,为研制和开发新型的恙虫病疫苗及临床诊断试剂奠定理论基础及物质保障。     

肿瘤坏死因子-α转换酶基因金属蛋白酶区的克隆及表达

目的: 克隆和构建含有肿瘤坏死因子-α转换酶金属蛋白酶区(metallopro teinase dom ain of human tumor necrosis factor-αconve rting enzyme,TACEmp)基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达。方法: 用RT-PCR方法,从THP-1细胞中扩增出TACEmp基因片段,插入表达载体pET-DsbAmut,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果: 克隆TACEmp基因并构建重组表达载体pET-DsbAmut-TACEmp转化入BL21,IPTG诱导后获得高效表达的TACEmp融合表达蛋白。结论: 利用分子伴侣融合蛋白技术使TACEmp在原核表达系统中获得了高效可溶性表达。     

人类5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶N端部分的克隆和表达

目的 :克隆人 5 ,10 亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTH FR)N端部分编码基因 ,构建重组表达载体并对其诱导表达 .方法 :通过RT PCR方法扩增出人胎肝组织MTHFR的N端部分 1116bp的核苷酸序列 ,克隆于载体pGEM Teasy ,测序分析后亚克隆于表达载体pGEX 4T 2 ,构建重组表达载体pGEX MTHFR(N) .结果 :经过转化E .coliJM10 9和BL2 1后 ,诱导表达出Mr 为 66× 10 3的蛋白 .SDS PAGE分析显示 ,表达量占全菌总蛋白质的 3 1%.结论 :获得了人MTHFR(N)编码基因及其原核表达菌株 ,对研究人MTHFR的生物学功能具有重要的意义 .     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。