体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

【目的】探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。【方法】取大鼠下肢骨骨髓，分离培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24h，相差显微镜下观察其形态变化，免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达，并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。【结果】MSCs经5-aza诱导后，部分细胞呈梭形，并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％，Desmin表达强阳性，RT—PCR示诱导后MSCs有MHC表达。【结论】MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞，是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为心肌样细胞的条件。方法抽取大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离MSCs进行培养、传代,在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,应用荧光免疫组织化学方法进行鉴定。结果大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观。诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,肌钙蛋白及Connexin43表达强阳性。结论大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究

目的观察体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同时间段分化为心肌样细胞的能力及表达心肌细胞特异性标志物的差别。方法分离培养SD大鼠BMSCs和SD乳鼠心肌细胞并鉴定,取第3代BMSCs分别进行5-氮胞苷(5-Aza)诱导、与心肌细胞共培养及单独培养,分别于第2、4、6、8、10周使用倒置显微镜观察细胞生长情况和形态变化,反转录-聚合酶链反应检测每组细胞心肌特异性基因肌钙蛋白I(cTnI)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和心肌特异性转录因子4(GATA-4)的表达。结果对照组未见有搏动细胞,cTnI、Cx43和GATA-4基因表达阴性;5-氮胞苷诱导组于第2周时细胞呈梭形且排列方向趋于一致,未见有搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达第8周达到高峰,GATA-4基因表达第4周达高峰;共培养组细胞多为梭形,呈肌性排列,可见搏动频率不一致的搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达于第2⁸周表达逐渐增加,GATA-4基因表达第6周达高峰;相同时段内,共培养组的cTnI、Cx43和GATA-4基因表达高于5-氮胞苷诱导组(P<0.05)。结论 BMSCs经5-氮胞苷诱导或与心肌细胞共培养可转化为心肌样细胞并表达基因cTnI、Cx43和GATA-4,且共培养组BMSCs分化为心肌样细胞的能力比5-氮胞苷诱导组强,推测心肌微环境可促进BMSCs定向分化为心肌样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：研究兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离、培养及向心肌细胞诱导分化的条件。方法：抽取兔髂骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化MSCs，第3代细胞（P3）用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD11b，CD90、CD29。以10μmol／L5-氮胞苷（5-aza）进行诱导分化，4周后，用倒置显微镜、透射电镜观察MSCs形态学变化及超微结构特征，RT—PCR检测心肌特异性β-肌球蛋白重链（β—MHC）、肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果：兔MSCs呈贴壁集落生长，流式细胞术检测显示P3细胞均一性在97％以上，纯度较高。诱导后细胞体积较诱导前增大，更加细长。14天后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。4周后，透射电镜下有肌丝、心房特殊颗粒及线粒体等心肌细胞超微结构形成。RT—PCR显示B—MHC、cTnI呈阳性反应。结论：MSCs在体外经5-aza诱导可以向心肌细胞进行分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化

目的 通过体外药物诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化，进一步验证其多能分化特性。方法 分离培养大鼠MSCs，5－脱氧杂氮胞苷（5－Aza－cdR）作用24h后继续培养4wk，电镜超微结构观察，免疫细胞化学染色鉴定。结果 5－Aza-cdR诱导4wk后的部分大鼠骨髓间充质干细胞α-Actinin,Troponin T阳性表达，电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央位置，胸质中可见富集的糖原颗粒及大量线粒体。结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，能在体外条件下经5－Aza-cdR诱导分化成心肌细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形。14d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应。结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

体外培养鼠骨髓间充质干细胞及其向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的 通过体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs),并用5-氮胞苷诱导其向心肌样细胞分化,研究MSCs生物学特性和5-氮胞苷效能.方法 将SD大鼠的骨髓采用贴壁法进行分离培养及传代增殖,相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制生长曲线,并用流式细胞仪技术检测CD29、CD45的表达,进行细胞成分鉴定.用5-氮胞苷体外诱导MSCs,观察其形态结构.用免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白(Desmin),用RT-PCR检测心肌特异因子基因β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达.结果 贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖较快.经5-氮胞苷诱导后,MSCs形态发生变化,可见肌管样结构.免疫组化和RT-PCR证实MSCs经体外诱导发生了向心肌样细胞的分化.结论 采用贴壁筛选法,简便易行,短期内可获得大量的纯度较高的骨髓间充质干细胞;在5-氮胞苷的诱导下,骨髓间充质干细胞呈现向心肌样细胞分化的趋势.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的状态.方法取健康SD大鼠骨髓,经密度梯度离心和贴壁培养获得MSCs,传至第两代,以10 μmol/L的5-氮杂胞嘧啶(5-aza)孵育诱导24h.培养4周,用免疫细胞化学染色方法鉴定心肌样细胞(cardiomyocyte-like cells);用全细胞膜片钳技术,检测胞膜内向钠电流,并与未经诱导的MSCs和急性分离的心肌细胞进行比较.结果MSCs经5-aza诱导后部分表达心肌特异性肌钙蛋白T,在诱导后4周记录到快速激活和失活的膜内向钠电流.与急性分离的心肌细胞比较,相同刺激脉冲下心肌样细胞所产生的电流幅值较小,Ⅰ-Ⅴ曲线向右偏移.结论经5-aza诱导后,MSCs可分化成具有兴奋性内向钠电流的心肌样细胞.     

兔骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞分化,进一步证实其多向分化特性.方法分离、培养兔的MSCs,将第5代的MSCs在体外经5-氮胞苷诱导4周后,进行免疫组化鉴定和电镜观察.结果5-氮胞苷诱导MSCs4周,部分细胞表达肌钙蛋白T（troponin T）,电镜观察到肌丝形成.结论MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,在体外经5-氮胞苷诱导可转化为心肌细胞.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征

[目的]体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(Ik1)特征.[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法鉴定诱导细胞,并采用全细胞膜片钳技术检测Ik1表达.[结果]诱导后细胞体积较诱导前增大,呈长梭形.14 d后细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致.免疫细胞化学染色显示Desmin、αt-sarcomeric actin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达.诱导细胞Ik1表达呈明显的不均一性,部分细胞Ik1与正常心室肌细胞相似,但Ik1电流密度总体上低于正常心室肌细胞.[结论]5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化;诱导细胞Ik1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能.     

Induced Differentiation of Human Cord Blood Mesenchymal Stem/Pro genitor Cells into Cardiomyocyte-like Cells In Vitro

Summary:The feasibility of usiug cord blood mesenchymal stem/progenitor cells(CB-MSPCs)to re-generate cardiomyocytes and the optimal inducing conditions were investigated.The CB mononuclearcells were cultured in low serum DMEM medium to produce an adherent layer.After expansion,theadherent cells were added into cardiomyocyte inducing medium supplemented with 5-azacytidine.Cardiogenic specific contractile protein troponin T staining was performed to identify the cardiomy-ocyte-like cells.The results showed that the frequency of CB-MSPCs clones in CB mononuclear cellswas 0.5×10~(-6) and about 1.3×10~7-fold expansion was achieved within 20 sub-cultivation.After car-diogenic induction,70％CB-MSPCs was differentiated into cardiomyocyte-like cells.It was indicat-ed that low serum culture could expand CB-MSPCs extensively and the expanded CB-MSPCs couldbe induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells in high efficiency.     

体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的：探讨体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞转化的条件。方法：分离大鼠骨髓，体外培养、传代得到骨髓基质细胞，观察不同浓度的诱导剂5-氮胞苷对骨髓基质细胞的生长和诱导作用，进行形态学和免疫组织化学鉴定。结果：5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后2周转化率为29％。心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)免疫组织化学染色阳性。结论：MSCs在体外条件下经5-氮胞苷诱导可分化成心肌样细胞。     

脐血间充质干细胞肌源性诱导分化的研究

目的研究脐血间充质干细胞 (MSC)体外的采集、培养和扩增 ,探讨MSC肌源性分化的条件和能力。方法选择杂种妊娠犬 11只 ,采集适量脐带血 ,常规分离后获得单核细胞 ,分别接种于不同的培养液中进行培养和体外传代扩增。免疫组织化学检测脐血MSC表面抗原的表达 ;5 -氮杂胞嘧啶核苷 (5 aza)诱导处理脐血MSC ,观察细胞形态结构的变化及肌源性标记物的表达。结果犬脐血MSC在IMDM中生长良好 ,增殖迅速 ,每传一代细胞扩增 2 ～3倍 ,传至 7代后细胞可扩增 1.5× 10 2～2 .0× 10 3 倍 ;脐血中包含破骨细胞样和纤维母细胞样贴壁细胞 ,后者CD2 9和CD71表达阳性 ,CD11a、CD11b和CD34表达阴性 ;脐血MSC在 10μmol/L的 5 aza诱导 3周后体积延长 ,与邻近细胞形成连接 ,并表达肌节性肌动蛋白和结蛋白 ,与阳性对照结果相似。 结论脐血MSC是存在于脐血中的一类不同于造血干细胞的原始细胞 ,在体外可大量扩增 ,在诱导剂的作用下向肌源性定向分化     

骨髓间充质干细胞向肌管状结构分化的动态

 【目的】探讨5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的最佳条件和体外分化的过程。【方法】体外培养Sprague-Dawley（SD）大鼠的MSCs，传代至P3、P6或P12；用5-氮胞苷诱导，比较不同诱导浓度组、不同诱导时间组和不同体重动物组MSCs的分化率，观察诱导后细胞分化过程中形态学的变化，并且用cardiactroponinⅠ、desmin和α-sarcomeric actin抗体鉴定分化的心肌样细胞。【结果】P12代较P3或P6代骨髓MSCs易向心肌样细胞分化并融合成肌管样结构。经10μmol／L的5-氮胞苷诱导24h后细胞分化率为（27±2．5）％，20μmol／L的5-氮胞苷诱导24h后细胞分化率为（17±2．2）%，其它诱导浓度和诱导时间均不能诱导细胞分化；50g（幼年鼠）体重组细胞分化率为（27±2．8）％，150g（成年鼠）体重组细胞分化率为（15±2．9）％，各组的差异有统计学意义。【结论】5-氮胞苷诱导MSCs向心肌样细胞分化并融合成肌管样结构，年幼的SD大鼠MSCs易向心肌样细胞分化。     

骨髓间质干细胞体外转化为心肌细胞的实验研究

目的：采用骨髓间质干细胞体外转化为心肌细胞，为心衰的干细胞移植治疗提供新的细胞材料。方法：抽取贵州香猪骨髓液3ml，按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞，经5-氮胞苷刺激24h后，进行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白-43免疫组化，电镜鉴定。结果：骨髓间质干细胞经5-氮胞苷刺激后，部分细胞呈梭形，结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白-43免疫组化阳性，电镜示梭形细胞有明显的肌丝，细胞核呈单椭圆形，位于细胞中央。结论：骨髓间质干细胞可在体外的环境下向心肌细胞转化，有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料。     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经细胞

目的探讨体外β-巯基乙醇(BME)、正规胰岛素(R I)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用。方法取体外扩增至3~4代的大鼠MSCs,分别用BME、R I和bFGF诱导,另设空白对照。诱导后1、5、24 h,计算神经元样细胞的分化率,分别鉴定神经元烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果诱导后1 h,BME组分化率最高,5 h时bFGF组分化率最高,与其他组有显著差异(P<0.01);BME组和R I组各自1 h与5 h的分化率有显著差异(P<0.01);bFGF组5 h和24 h的分化率与1 h的分化率有显著差异(P<0.01),但5 h和24 h的分化率无显著差异(P>0.05)。结论抗氧化剂和神经营养因子能诱导MSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率。胰岛素的作用较弱;BME的诱导作用快而短暂;bFGF的诱导作用缓和而持久。