抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建

目的：构建一个含M1RNA、具有特异性抗慢性粒细胞性白血病（CML）细胞融合基因bcr/ablmRNA的真核表达载体，以用于CML的分子靶向治疗。方法：以pTK117为模板，通过PCR方法合成一个带有导引序列（GS）的M1RNA，再将PCR产物克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到重组质粒pAVGS4，转化大肠埃希菌JM109，以碱裂解法小量抽提，酶切电泳鉴定，并测序鉴定。结果：以EcoRI和SalI酶切、1％的琼脂糖凝胶电泳显示在500和6500bp附近各有一条明亮的条带。应用PCR方法测序的结果与模板序列一致。结论：构建的pNAV-1经酶切和测序鉴定，与目标序列一致，含有核酶、具有抗bcr/abl mRNA的真核表达载体构建成功，预期可用于CML细胞株和原代细胞的实验研究。     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因的表达

目的：研究慢性粒细胞性白血病患者bcr／abl融合基因阳性率及其临床意义。方法：取慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓或外周血，提取单核细胞的总RNA，用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，观察其ber／abl基因的表达。结果：9例CML患者中，8例ber／abl基因阳性，占88.9％。结论：bcr／abl基因检测可以用来辅助CML的临床诊断。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

bcr/abl基因在慢性粒细胞性白血病中的发病作用及bcr/abl反义基因治疗

慢性粒细胞性白血病(CML)最有效治疗手段为骨髓移植(BMT)。但异体BMT供髓者缺乏，且有发生移植物抗宿主病的危险。自体BMT常因骨髓净化不彻底导致复发。所以探讨CML细胞生物学行为改变的原因，是探索CML病因进而力争治愈CML的关键。 　　1　bcr/abl表达产物及功能 　　90%以上CML患者骨髓全部造血细胞内出现Ph1染色体，由位于9号染色体q34.11的c-abl基因与位于22号染色体q11.21的c-sis基因相互易位，形成t(9;22)(q34.11;q11.21)所致。22号染色体上断裂点集中在约5 800 bp的区域内，称M-bcr。CML中bcr/abl融合方式有2种：bcr第3及第2外显子分别与abl第2外显子融合成b3a2及b2a2型，二者差75 bp，均表达210 000的蛋白，即p210bcr/abl (p210)。此外还有bla2型(p185)，主要见于ALL。     

染色体核型和bcr/abl融合基因表达与慢性髓细胞白血病急变的关系

目的 探讨慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)的细胞遗传学特性及其与病程发展的关系.方法 短期培养法直接法G显带检测CML的骨髓染色体核型,双色荧光原位杂交检测CML的bcr/abl融合基因,统计学方法采用t 检验.结果 264例CML患者的骨髓染色体检测,检测出Ph染色体阴性14例,阴性率5.3 %,其余为Ph染色体阳性,阳性率为94.7%.在观察到CML急变的43例患者中,标准Ph染色体22例,Ph染色体阴性9例,双Ph染色体2例,变异Ph染色体3例,标准Ph染色体伴其它染色体易位3例,Ph染色体阴性伴其它染色体易位1例,Ph染色体阴性伴倒位2例,Ph染色体阳性伴倒位1例.43例患者中24例患者急变时发生了染色体核型及融合基因改变,19例患者染色体核型及融合基因没有发生变化;[t(9;22)(q11;34)]的CML患者与[Ph-,变异Ph,复杂染色体]的CML患者急变时间(月)差异有统计学意义(P＜0.05).结论(1)慢性髓细胞性白血病加速/急变期发生克隆演化;(2)[Ph-,变异Ph,复杂染色体]的CML患者急变时间(月)明显短于[t(9;22)(q11;34)]的CML患者;(3) 染色体核型和bcr/abl融合基因表达可为诊断提供可靠、可循的依据,对预后判断有重要意义.     

ES探针荧光原位杂交法检测bcr/abl融合基因

目的探讨应用ES型bcr/abl探针(双色单融合)荧光原位杂交技术(FISH)在检测bcr/abl融合基因中的价值。方法慢性髓细胞性白血病(CML)初诊或复诊患者30例(骨髓标本43份),行普通染色体核型分析和ES型bcr/abl探针荧光原位杂交分析。结果 43份骨髓标本,6份未做骨髓培养,6份培养失败,在其余31份培养成功的标本中,找到Ph1染色体9份,另有1份标本多次检查都发现存在21p+染色体异常;43份骨髓都经FISH检测,13份标本发现bcr/abl融合基因。结论 ES型bcr/abl探针对CML初诊病例的bcr/abl融合基因有较高的检出率;对复发病例,不仅能辅助诊断CML,而且在监测白血病微小残留病灶、判断疾病的进展上均有较高的灵敏度。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达及临床意义

目的 探讨bcr/abl融合基因的表达在慢性粒细胞白血病(CML)中的诊断、疗效及预后观察中的意义.方法 采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(FQ -PCR)技术,对8例复治CML患者和作为对照组的2例急性非淋巴细胞性白血病患者的骨髓或外周血进行bcr/abl融合基因检测;同时比较患者的血象、骨髓象等相关实验室指标.结果 CML中7例慢性期(CP)和1例急变期(BC)患者,均不同程度地表达了bcr/abl融合基因,而对照组该融合基因的表达为阴性.结论 bcr/abl基因是CML发病的分子基础,定量检测bcr/abl融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义.     

慢性粒细胞白血病特异性bcr—abl三核酶体外转录载体的构建及鉴定

0引言her－abl融合基因编码的具有异常蛋白酪氨酸激酶活性的P210蛋白，是导致慢性粒细胞白血病（。hronicmveloidleukemia，CML）发生的主要原因．针对her－abl的核酶能有效抑制PZ10蛋白的合成，诱导CML细胞凋亡，是CML基因治疗的新思路．有关核酶及多核酶治疗CMI。的试验研究国内尚未见报道．成功构建了her－abl单核酶、双核酶及三核酶体外转录载体，为今后透选特异、高效的核酶载体，进一步开展CML的试验治疗奠定基础．互材料和方法1．l材料pGEM－3Zf载体购自华美公司，核酶基因单链由上海生工生物工程有限公司合成．1．2质粒提…     

DNA聚合酶β靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA聚合酶β（polβ）靶向的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体。方法：根据GenBank中人DNApolβ基因（M13140）的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论：成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。     

初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子与临床关系的观察

目的　研究初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子类型与临床关系。方法　使用RT PCR对 5 1例初发CML患者进行bcr/abl融合基因转录子检测。结果　b3a2型患者血小板数高于b2a2型患者 ,但b3a2型患者WBC数低于b2a2型患者 (P <0 .0 5 ) ;血红蛋白浓度与b2a2型患者比较无差异 (P >0 .0 5 ) ;b3a2型和b2a2型患者比较AKP和Ph1染色体比例无差异 (P >0 .0 5 ) ;M bcr/abl阳性患者伴m bcr/abl阳性率为 47 0 % ,其中b3a2型患者有m bcr/abl融合基因转录子 14例 ,b2a2型患者有 10例。结论　b3a2型CML患者初发时更易有血小板升高表现 ,但b2a2型患者更易有WBC数升高的表现 ,较多的初发CML患者同时伴有m bcr/abl阳性。     

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的 构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体，并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术．将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中，构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38，经EcoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞，通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果 经EfoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论 证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达，为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。     

Ph1染色体及bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病中的诊断意义

目的 探讨Ph1染色体和bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断中的意义.方法 选择28例慢性粒细胞白血病患者和20例缺铁性贫血患者作为研究对象,采用骨髓细胞短期培养法制备染色体、采用RT-PCR法分析bcr/abl融合基因.结果 28例慢性粒细胞白血病患者中,Ph1染色体阳性者25例(89.3%),bcr/abl阳性者26例(92.9%),Ph1和bcr/abl均阳性25例(89.3%),Ph1阴性、bcr/abl阳性1例(3.6%),Ph1和bcr/abl均阴性2例(7.1%).20例缺铁性贫血患者Ph1和bcr/abl均阴性.结论 Ph1染色体、bcr/abl融合基因的检测有助于慢性粒细胞白血病的诊断和鉴别诊断.     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞,用WST-8法检测细胞增殖抑制率;RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例;Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后,明显抑制K562细胞增殖,各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05);②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平,各浓度组间差异无显著性(p>0.05);③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期;④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群,各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05),细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达,抑制细胞的增殖,诱导凋亡,但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

survivin启动子的真核表达载体构建

目的构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv。方法用PCR扩增survivin启动子,构建其真核表达载体并检测survivin启动子的活性。结果PCR成功扩增出survivin启动子,其真核表达载体构建成功。结论survivin启动子能驱动EGFP的表达,证明其具有活性。     

双色ES探针检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的应用研究

目的:探讨使用bcr/abl双色ES探针的荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization,FISH)应用于慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因检测的意义.方法:使用荧光原位杂交方法对2005年1月至2006年2月本院收治的12例慢性粒细胞白血病患者之骨髓细胞进行检测分析.结果:12例CML均检出bcr/abl基因的存在,其中2例伴ASS基因缺失.结论:使用bcr/abl双色ES探针进行荧光原位杂交能为bcr/abl融合基因的检测提供准确直观的依据.     

慢性粒细胞白血病Ph1染色体和bcr/abl融合基因检测的意义

目的：探讨Ph¹染色体和bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断中的意义。 方法：选择95例慢性粒细胞白血病患者和20例缺铁性贫血患者作为研究对象,采用骨髓细胞短期培养法制备染色体、采用RT-PCR法分析bcr/abl融合基因。 结果：95例慢性粒细胞白血病患者中,Ph¹染色体阳性者83例（87.4%）,bcr/abl阳性阳性者90例（94.7%）,Ph¹和bcr/abl均阳性83例（94.7%）,Ph¹阴性、bcr/abl阳性7例（7.4%）,Ph¹和bcr/abl均阴性5例（5.3%）。20例缺铁性贫血患者Ph¹和bcr/abl均阴性。 结论：Ph¹染色体、bcr/abl融合基因的检测有助于慢性粒细胞白血病的诊断和鉴别诊断。