先天性小耳畸形EYA1基因启动子区域甲基化初步研究

目的 探讨先天性小耳畸形EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化状态.方法 应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术,检测了64例先天性小耳畸形患者和36例健康对照的EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化情况.结果 先天性小耳畸形患者EYA1基因的CpG_Unit3和CpG_Unit5甲基化程度分别为0.092 58±0.033 846和0.092 2±0.023 79,与健康对照相比明显降低,其差异具有统计学意义(P=0.001和0.019).结论 先天性小耳畸形存在EYA1基因低甲基化情况,可能与该病的发生发展相关.     

SFRP2启动子CpG岛高甲基化与结直肠癌的相关性

目的:研究SFRP2启动子中CpG岛高甲基化与结直肠癌临床特点之间的相关性。方法:通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术检测特定CpG岛甲基化程度,采用Sequenom EpiTYPER技术检测20例结肠癌中正常组织和肿瘤组织中SFRP2启动子甲基化状态。结果:SFRP2_01_CpG_5(P=0.018)、SFRP2_02_CpG_5(P=0.018)与肿瘤位置相关,SFRP2_02_CpG_6、7、8、9(P=0.039)与淋巴结转移个数有关。SFRP2_01_CpG_1.2(P=0.043)、SFRP2_02_CpG_16(P=0.044)与肿瘤直径大小相关。结论:启动子CpG位点甲基化水平与结直肠癌的临床及病理特点有相关性,表明SFRP2启动子可能是结直肠癌的现阶段和未来进展的潜在的表观遗传学的生物学标志物。     

外周血Runx3基因CpG岛甲基化在结肠癌病情及预后评估中的价值

目的:研究外周血Runx3基因CpG岛甲基化在结肠癌病情及预后评估中的价值。方法:选择结肠癌患者(观察组)和正常人(对照组)为研究对象,检测两组外周血Runx3基因CpG岛甲基化,分析结肠癌患者不同临床病理因素外周血Runx3基因CpG岛甲基化的差异,比较外周血Runx3基因CpG岛甲基化与未甲基化患者5年生存率及总生存时间的差异。结果:观察组外周血Runx3基因CpG岛甲基化率显著高于对照组(P<0.05)。观察组结肠癌低/中分化、肿瘤最大径≥6 cm、有淋巴结转移、有远处转移、Ⅲ/Ⅳ期和非根治性手术患者Runx3基因CpG岛甲基化率显著高于高分化、肿瘤最大径<6 cm、无淋巴结转移、无远处转移、Ⅰ/Ⅱ期和根治性手术患者(P<0.05)。观察组结肠癌患者Runx3基因CpG岛甲基化患者3年生存率及总生存时间均显著低于未甲基化患者(P<0.05)。结论:结肠癌患者外周血Runx3基因CpG岛处于高甲基化状态,在结肠癌病情及预后评估中具有重要价值。     

人原发性肝癌中多种基因CpG岛甲基化研究进展

1概述在表观遗传学(epigenesis※)这个发展非常快的领域,DNA甲基化,组蛋白去乙酰化和RNA介导是基因沉默(silencing)的三大主要原因。在人类基因组DNA中,约3%～4%的胞嘧啶碱基以5甲基胞嘧啶形式存在,结果导致在人类正常组织细胞DNA中,5甲基胞嘧啶占所有核甘酸碱基的0.75%～1%。大约70%～80%的5甲基胞嘧啶存在于CpG序列中,CpG二核甘酸集中的区域称之为CpG岛,这部分通常是未甲基化,这些CpG岛跨过许多基因的5’末端———包括启动子,未翻译区和第一外显子。现在知道的哺乳类基因组中至少一半基因的启动子区存在CpG岛,其甲基化只发生在…     

散发性肝外胆管癌中RASSF1A基因启动子甲基化状态的研究

目的　检测肝外胆管癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化及各CpG位点甲基化发生率。方法　采用甲基化特异性聚合酶链反应 (MS PCR)和半巢式PCR对RASSF1A基因启动子区域进行扩增 ,并对扩增产物克隆测序。结果　在全部 48例肝外胆管癌组织中 ,RASSF1A基因启动子区域存在CpG位点甲基化现象的共 2 8例 ,16个CpG位点甲基化平均发生率为 42 .45 % ,明显高于对照组 (χ2 =11.77,P <0 .0 1)。结论　RASSF1A基因启动子区域CpG岛甲基化是RASSF1A失活的主要机制 ,在肝外胆管癌的发生过程中发挥重要作用。     

肝癌患者E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨抑癌基因E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌(简称肝癌)发生、发展的关系,及其在肝癌早期诊断中的意义。方法用巢式甲基化特异性PCR对34例肝癌患者的癌组织、距离癌灶边缘>3 cm的远癌组织及10例未发生肝癌的肝硬变患者的肝硬变组织中E-cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测。结果 E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化阳性率,在34例肝癌组织中为61.76%(21/34),明显高于远癌组织中的29.41%(10/34),P<0.05;在10例无肝癌的肝硬变组织中为50.00%(5/10),与肝癌组织和远癌组织比较差异均无统计学意义(P>0.05);在4例正常肝组织中均为甲基化阴性。联合检测癌组织E-cadherin基因CpG岛甲基化与血清甲胎蛋白两种分子标志物,肝癌的检出率可达82.35%。结论抑癌基因E-cadherin启动子区CpG岛甲基化可能在肝癌的发生、发展中起到重要作用,并且可能是早期事件,其在肝癌的临床诊断及治疗中的意义值得进一步深入研究。     

乳腺癌WWOX基因表达缺陷的意义及其与CpG岛甲基化的关系

目的 研究WWOX蛋白在乳腺癌组织和细胞系中的表达变化,分析其与WWOX基因启动子和第一外显子CpG岛甲基化的关系.方法 应用免疫组织化学染色检测乳腺癌组织和细胞系中WWOX蛋白表达,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)分析乳腺癌组织和细胞系中WWOX基因CpG岛甲基化状况.结果 32.2%的乳腺癌组织和5.4%正常乳腺组织中WWOX蛋白表达缺失,差异有统计学意义(P＜0.01).乳腺癌组织WWOX表达异常与绝经后状态(P＜0.01)关系密切.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者中WWOX蛋白表达缺失的比例分别为23.1%、28.6%和46.2%.55%的乳腺癌组织WWOX启动子CpG岛甲基化扩增,45%的乳腺癌组织WWOX第一外显子CpG岛甲基化扩增,癌旁组织中未出现CpG岛甲基化扩增.MDA-MB-231细胞WWOX基因CpG岛完全甲基化,而MCF-7细胞无甲基化产物扩增.结论 乳腺癌中广泛存在着WWOX基因CpG岛甲基化,是WWOX表达缺陷的重要机制,并且可能通过性激素受体信号途径在乳腺癌的发生、发展中发挥作用.     

散发性结直肠癌CpG岛甲基子表型和基因组遗传学不稳定性的关系

目的探讨散发性结直肠癌CpG岛甲基子表型和基因组不稳定性的关系。方法对采用甲基化特异性PCR的方法对71例散发性结直肠癌组织进行P14^ARF、hMLH1、P16^INK4a、MGMT和MINT1共5个基因启动子甲基化的检测,确定CpG岛甲基子表型;选择BAT25和BAT26两个位点进行微卫星不稳定检测和流式细胞术检测分析倍体类型;分析散发性结直肠癌中CpG岛甲基子表型和微卫星不稳定、染色体不稳定的关系。结果全组结直肠癌组织中CpG岛甲基子表型的阳性率为21.1%（15/71）;微卫星不稳定的阳性率为9.9%（7/71）;异倍体的阳性率为73.5%（50/68）。CpG岛甲基子表型阳性者,微卫星不稳定的阳性率高于阴性者（20.0%vs7.1%）,但差异无统计学意义（P=0.158）。hMLH1基因启动子甲基化阳性者微卫星不稳定的比例为57.1%,高于阴性者的4.7%（P=0.001）。CpG岛甲基子表型阳性者二倍体的比例高于阴性者（61.5%vs.18.2%,P=0.003）。结论CpG岛甲基子表型阳性的散发性结直肠癌具有显著的二倍体倾向,多基因同时甲基化和染色体不稳定可能是两种相互独立的基础性发病机制。     

原发性肝癌RASSF1A基因启动子区甲基化及其临床意义

目的 探讨原发性肝癌中RASSF1A基因启动子的甲基化水平及其与临床病理特征的关系.方法 采用MSP测定100例原发性肝癌患者的肿瘤标本及其癌旁组织、6株肝癌细胞株及10例正常肝组织RASSF1A基因甲基化状态,分析甲基化与肝癌临床病理特征的关系.采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理肝癌细胞株,用RT-PCR检测RASSF1A的重新表达情况.结果 100例肝癌组织中有69例(69％)存在RASSF1A基因CpG岛的异常甲基化,癌旁组织中有15例(15％),6株肝癌细胞株有4株(4/6)发生甲基化,而正常肝组织中无RASSF1A基因甲基化存在,RASSF1A基因异常甲基化在3种组织中的发生率差异有统计学意义(x2=67.75,P＜0.001).RASSF1A基因启动子甲基化与患者乙肝表面抗原及组织分化存在一定相关性.发生甲基化的4株肝癌细胞株经甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理后,全部重新恢复表达.结论 原发性肝癌存在RASSF1A基因CpG岛异常甲基化,并与患者乙肝表面抗原及组织分化密切相关.经甲基化抑制剂处理的肝癌细胞株又重新恢复表达,推测CpG岛的甲基化可能是导致其基因表达降低的主要原因之一.     

肝细胞癌抑癌基因和癌基因甲基化水平的检测及意义

目的:探讨DNA甲基化异常在肝癌发展中的作用.方法:应用甲基敏感的限制性内切酶及Southern杂交技术对18例肝细胞癌抑癌基因Rb、17p13.3位点基因CpG岛和癌基因c-myc3′端散在CpG的甲基化状态进行了检测.结果:1例肝透明细胞癌和41.7%(5/12)肝细胞癌分别存在Rb基因和17p13.3位点基因CpG岛的高甲基化;而c-myc基因3′端散在形式的CpG岛的甲基在61%的肝癌发生不同程度的丢失,这种高和低甲基化状态可同时存在于同一病例.甲基化异常可发生在早期肝癌并随肿瘤进展而加重.结论:本实验结果表明:肝细胞癌存在严重的DNA甲基化紊乱,可能是抑癌基因失活和癌基因激活的重要因素.     

硫喷妥钠对CpG DNA诱导人外周血单个核细胞NF-κB表达和TNF-α、IL-6释放的影响

目的 探讨硫喷妥钠对CpG DNA诱导人外周血单个核细胞(hPBMC)核因子-κB(NF-κB)表达及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)释放的影响.方法 采集健康志愿者外周血,使用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心分离hPBMC.分别加入不同浓度的硫喷妥钠后(0.2～1.0 mg/ml),ELISA测定hPBMC培养上清中TNF-α和IL-6浓度,确定硫喷妥钠对CpG DNA刺激细胞分泌TNF-α及IL-6的抑制作用及其剂量-效应关系和时间-效应关系;免疫蛋白印迹法(Western blotting)分析hPBMC胞核NF-κB表达.结果 不同浓度的硫喷妥钠(0.2～1.0mg/ml)显著抑制CpG DNA诱导hPBMC NF-κB P65表达和TNF-α、IL-6释放(P<0.05或P<0.01).提前1～4 h给予硫喷妥钠或同时给予硫喷妥钠和CpG DNA(0 h),其拮抗CpG DNA诱导细胞因子释放的作用非常显著(P<0.01),且硫喷妥钠在刺激物CpG DNA给予后1 h再加入,也能观察到显著拮抗作用(P<0.05).结论 硫喷妥钠可通过下调CpG DNA诱导hPBMC NF-κB P65表达,从而降低促炎细胞因子TNF-α和IL-6的释放.     

肝细胞癌的CpG岛甲基化表型研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一.目前,已在人类多种恶性肿瘤中发现了以多个基因同时甲基化为特征的CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)的存在.CIMP对肝癌的发生、发展、转移、复发等过程具有重要作用.检测肝癌相关基因的甲基化状态可以为肝癌的早期诊断、肝癌分型,预测肝癌复发、转移和预后判断提供非常有价值的信息.     

氩氦刀冷冻联合CpG寡脱氧核苷酸治疗小鼠皮下移植性结肠癌

目的 探讨氩氦刀冷冻消融联合CpG寡脱氧核苷酸（ODN）对小鼠移植性结肠癌的治疗作用.方法 BALB/c小鼠皮下接种结肠癌CT26细胞建立荷瘤鼠模型,小鼠被分成PBS组（6只,瘤周注射PBS组）、氩氦刀组（6只,氩氦刀冷冻组）、CpG ODN组（6只,瘤周注射CpG ODN）和联合治疗组（6只,氩氦刀冷冻加瘤周注射CpG ODN）.观察各组小鼠存活及肿瘤生长情况;采用酶联免疫吸附试验检测小鼠外周血中IL-12和IFN-γ的含量;利用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD3＋CD4＋T细胞与CD3＋CD8＋T细胞比例;对氩氦刀组和氩氦刀联合CpG ODN组治愈小鼠进行再攻击实验,观察小鼠再次成瘤率.结果 氩氦刀组和联合治疗组小鼠的平均生存时间为（80.3±5.4）d和（83.8±5.5）d,明显长于PBS组[（53.7±3.7）d]和CpG ODN组[（51.5±6.8）d],差异均有统计学意义（P＜0.05）.氩氦刀组和联合治疗组抑瘤率分别为83.8%和86.2%.治疗后20 d,氩氦刀组和联合治疗组的CD3＋CD4＋T细胞/CD3＋CD8＋T细胞比值、IL-12和IFN-γ水平均高于PBS组和CpGODN组,差异有统计学意义（P＜0.05）;与氩氦刀组比较,联合治疗组CD3＋CD4＋T细胞/CD3＋CD8＋T细胞比值差异无统计学意义,但IL-12和IFN-γ水平则显著升高（P＜0.05）.肿瘤再攻击后,氩氦刀组和联合治疗组分别有5只（5/6）和1只（1/6）再次成瘤,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 氩氦刀冷冻联合CpG ODN可以增强荷瘤鼠的抗肿瘤免疫应答,增强了氩氦刀治疗小鼠的免疫功能,减少了肿瘤再次攻击的成瘤率.     

Promoter hypermethylation of GSTP1, AR, and 14-3-3sigma in serum of prostate cancer patients and its clinical relevance

OBJECTIVE: Hypermethylation of tumor suppressor genes (TSG) is thought to play an important role in tumorigenesis of prostate cancer. The main focus of research was the detection of TSG hypermethylation in cancer tissue. Our aim was to evaluate the feasibility of detection of hypermethylated genes in serum of prostate cancer patients and its correlation with clinicopathological parameters. METHODS: One hundred twenty-five serum samples from 62 patients with hormone refractory prostate cancer (HRPC), 14 patients with early disease, and 49 healthy controls were examined. After DNA extraction and sodium-bisulfite treatment, conventional methylation-specific PCR (MSP) was performed for glutathione S-transferase P1 (GSTP1), androgen receptor (AR), and 14-3-3sigma. RESULTS: In serum of HRCP patients, frequency of GSTP1, AR, and 14-3-3sigma hypermethylation was 32.2, 40.3, and 86.6%, respectively. In serum of patients with early disease frequency of GSTP1, AR, and 14-3-3sigma, hypermethylation was 21.4, 35.7, and 85.7%. In healthy controls, frequency of GSTP1, AR, and 14-3-3sigma hypermethylation was 0, 26.5, and 55.1%, respectively. There was a significant increase of frequency of TSG hypermethylation for GSTP1 and 14-3-3sigma in HRPC patients, in comparison with healthy controls. GSTP1 hypermethylation in HRPC patients was significantly correlated with differentiation of cancer and metastatic disease. CONCLUSIONS: Hypermethylation of TSG can be detected in serum of prostate cancer patients. Some hypermethylated TSG can be detected in serum of healthy controls. GSTP1 was not detectable in controls and correlated significantly with Gleason score and stage of disease. Therefore, this gene may be a promising new tool in prostate cancer diagnosis.     

Experimental therapy of prostate cancer with an immunomodulatory oligonucleotide: effects on tumor growth, apoptosis, proliferation, and potentiation of chemotherapy

BACKGROUND: The present study was designed to demonstrate the therapeutic efficacy of a novel immunomodulatory oligonucleotide (IMO) for prostate cancer. METHODS: We evaluated the effects of the IMO in xenograft (PC-3) and syngeneic (TRAMP C1) models of prostate cancer, and in prostate cancer cells. The IMO was also evaluated in combination with chemotherapy, and the in vitro expression of TLR9 was examined. RESULTS: The IMO had significant anti-tumor activity in both prostate cancer models and almost complete tumor regression was observed when the IMO was combined with taxotere or gemcitabine. TLR9 mRNA and protein were both expressed in prostate cancer cells. The IMO also induced apoptosis and decreased proliferation and survival of PC-3 cells in vitro in the presence of Lipofectin. CONCLUSIONS: The IMO inhibits prostate cancer growth in vivo and in vitro, and potentiates the effects of conventional chemotherapeutic agents. This is the first report of TLR9 expression in prostate cancer cells.     

肝癌细胞NFAT2基因启动子区甲基化与其mRNA表达的关系

目的:探讨肝癌细胞中NFAT2基因启动子CpG岛甲基化状态及与其mRNA表达的关系。方法:用重硫酸盐测序法检测肝癌组织与癌旁组织及不同肝细胞系与正常肝细胞中NFAT2启动子甲基化状态,用qRT-PCR检测肝癌组织与癌旁组织NFAT2 mRNA表达,并分析肝癌组织NFAT2启动子甲基化与mRNA水平的相关性。结果:肝癌组织中NFAT2基因CpG岛甲基化率明显高于癌旁组织(33.0%vs.21.6%,P=0.003);人肝癌细胞系HuH7、HepG2、Hep3B中NFAT2基因CpG岛甲基化率分别为34.8%、40.4%、37.0%,均明显高于人正常肝细胞系L02中NFAT2基因CpG岛甲基化率(16.2%)(均P0.05)。肝癌组织NFAT2 mRNA相对表达量明显低于与癌旁组织(0.000 602 4 vs.0.001 469,P0.05),肝癌组织中NFAT2 mRNA水平与其启动子甲基化程度呈明显负相关(r=-0.661,P=0.027)。结论:肝癌细胞中NFAT2基因表达下调可能与其启动子区CpG岛高甲基化状态有关     

ER基因CpG岛甲基化的表达及其临床意义

目的:研究ER基因表达及CpG岛甲基化状况与胃癌生物学行为和预后的关系.方法:分别应用免疫组化SP法和限制性内切酶PCR法分析91例胃癌ER的表达和30例胃癌ER墓因CpG岛甲基化的状况.结果:胃癌ER阳性率为38%(35/91),其中高分化腺癌10%(3/30),分别与低分化腺癌43%(13/30)、未分化腺癌53%(8/15)、粘液癌63%(5/8)及印戒细胞癌75%(6/8)比较皆具有显著性差异(P＜0.05);伴淋巴结转移组为55%(11/20),未转移组22.5%(9/40),差异有显著性(P＜0.05).正常胃粘膜ER基因CpG岛未甲基化,而胃癌呈高度甲基化40%(12/30)(P＜0.05).结论:ER在胃癌中的表达与浸润、转移有关,ER阳性胃癌生物学行为差,ER基因CpG岛甲基化可能是胃癌中ER失表达的分子机制.