河南省唐河县分离到基因1型乙型脑炎病毒

目的 从河南省唐河县采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎病毒(JEV)并确定其基因分型及E基因区段氨基酸序列特征.方法对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA3.1完成病毒进化分析,GENEDOS(3.2)软件完成氨基酸位点分析.结果共采集3722只蚊虫标本,包括:库蚊、骚扰阿蚊、伊蚊及按蚊.从库蚊标本中分离到3株属于基因1型的乙脑病毒,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA14-14-2株的同源性分别为86.9%～87.7%,氨基酸同源性为95.2%～97.0%,存在12处共同的氨基酸位点差异.结论从河南省唐河县首次分离到基因1型的乙脑病毒.E基因与疫苗株相比有部分氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离乙脑病毒.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

2008年甘肃省新分离乙脑病毒的分子生物学特征

目的 对2008年甘肃省新分离乙脑病毒的PrM和E基因区段进行序列测定和分析,明确新分离病毒的基因型别并对E基因序列的分子特征进行分析.方法 对新分离乙脑病毒的PrM和E基因区段进行PCR扩增并测定序列.使用ClustalX2.09、MegAlign和Mega4软件对核苷酸和氨基酸序列进行分析并绘制系统发生树.结果 系统进化分析结果显示6株病毒均为基因Ⅰ型乙脑病毒,并且与2001和2002年越南分离株、2004年日本分离株及2004年我国四川省分离株进化关系较近.新分离株与减毒活疫苗株SA14-14-2相比,E基因核苷酸同源性为87.5%～87.9%,氨基酸同源性为96.8%～97.2%.新分离株与疫苗株在E基因区段存在11处共同位点的氨基酸差异.结论 2008年甘肃省分离的乙脑病毒均为基因Ⅰ型乙脑病毒,新分离株E基因氨基酸序列与疫苗株相比有部分差异,但均不属于决定抗原性的关键位点.     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析

目的 为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料,研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度,为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据.方法 设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因,PER产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定.通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 新分离乙脑病毒XJ69和NJP613株全基因组全长均为10 964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸.与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.5%～99.2%,氨基酸总体同源性为97.5%～99.7%.通过PrM/C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型,与上海三带喙库蚊分离株SH17M-07关系最为接近.     

辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定

目的 对2002年辽宁省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 从辽宁省采集蚊虫标本4927只，用细胞培养的方法分离病毒，对新分离的病毒进行血清学（ELISA和IFA方法）、分子生物学鉴定。结果 本实验共研磨蚊虫标本50批，分离到2株病毒，命名为LN02-102、LN02，104。这2株病毒均可致BHK-21细胞病变（CPE）（2—3d），致Vero细胞病变（2—4d），也可致C6／36细胞病变（2—4d）。对3日龄乳鼠2—3d可致死。这2株病毒可与标准乙脑病毒抗体反应。利用病毒PrM区段（基因组456-695核苷酸）进行基因分型分析。新分离的2株病毒属于基因Ⅰ型乙脑病毒。对这2株病毒的E基因区段进行分析，它们之间核苷酸和氨基酸的同源性为100％，与疫苗株SA14-14-2相比，核苷酸差异为4．11％，氨基酸差异在0．60％。结论 在辽宁省采集的蚊虫标本中分离到2株病毒，经血清学和分子生物学鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒，是近年来在辽宁省首次分离到基因Ⅰ型的乙脑病毒。     

从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组序列特征研究

目的通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了从脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）全基因组序列特征,以了解其致病性的分子基础。方法采用RT．PCR法和核酸序列测定法获得病毒基因组全序列,并利用DNASTAR、ClustalX version2．0．9及MEGAversion4．1等生物学软件分析该乙型脑炎病毒核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化等。结果研究结果表明从病毒性脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）基因组全长为10965nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示GZ56株全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因I型乙脑病毒（M-28株）处于同一进化分支。GZ56株与其他基因I型乙脑病毒核昔酸和氨基酸序列同源性分别为96．2％～98．6％和98．2％～99．7％。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。结论本研究提示,从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组未见明显变化,从基因组水平可以推测该病毒可以被现行的乙脑疫苗所保护。     

中国分离乙脑病毒与灭活疫苗株(P3株)E基因差异分析

目的 分析我国近年来从蚊虫及患者标本中分离的乙脑病毒与灭活疫苗株（P3株）之间在E基因区段核苷酸及氨基酸差异。方法 从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列，通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行分析。结果 P3株与福建分离株之间核苷酸同源性在98．3％-98．5％之间、氨基酸同源性在98．2％-98．6％之间；P3株与上海分离株之间核苷酸同源性在88．0％-88．5％之间、氨基酸同源性在98．0％-98．4％之间。E基因区段500个氨基酸中P3株与所有新分离乙脑病毒株之间共存在19个位点的差异，其中在E-76、E-306、E-408处所有新分离毒株与P3株存在共同的差异；在E-160、E-487处福建分离株与P3株存在共同差异；上海分离株与P3株在E-129、E-222、E-227、E-366存在共同差异。结论 上海蚊虫中分离的Ⅰ型乙脑病毒和福建省脑炎患者中分离的Ⅲ型乙脑病毒与P3株在E基因的部分氨基酸位点存在差异，但均不处在影响病毒生物学特性的关键位点。     

四川省流行性乙型脑炎病毒优势基因型的研究

目的了解四川省乙脑主要流行区乙脑病毒的分子生物学特性,为防治提供依据。方法对2007-2010年间分离到的13株乙脑病毒进行PreM和E基因区扩增,采用MEGA5生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果基因分型显示13株均属于基因I型。13株病毒之间比较,PreM基因核苷酸和氨基酸同源性为97％-100％和98．7％-100％,E基因核苷酸和氨基酸同源性为97．8％～99．9％和99．6％～100％,其同源性极高。13株病毒与2004年四川分离株比较E基因核苷酸同源性在97．7％～99．6％之间,氨基酸同源性在98．6％-100％之间;PreM基因的核苷酸同源性在96．2％-99．1％之间,氨基酸同源性在97．5％-98．7％之间;与疫苗株P3和SA14—14—2比较E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为87．6％～88．3％和97％～97．8％;PreM基因核苷酸和氨基酸同源性分别为84．1％～85．8％和93．7％-96．2％。13株病毒E基因的8个氨基酸毒力位点均没有发生改变。结论四川省乙脑病毒已呈现基因I型为优势型别的态势,其PreM和E区核苷酸和氨基酸高度保守,关键的氨基酸毒力位点没有变化,提示目前使用的疫苗对流行株的感染具有保护作用。     

基因芯片技术的研究进展

基因芯片技术的诞生是基于人类基因组计划的成果,它以一种全面、综合、系统的思维方式来研究生命现象。同时,它还是疾病诊断和治疗的重大方法学突破,也是新药开发筛选的新方法。     

DMD基因突变及突变检测技术研究进展

假性肥大型进行性肌营养不良（DMD／BMD）一类发病率较高的X连锁隐性遗传病。DMD基因庞大,突变机制复杂,随着分子生物学的进展,对DMD基因及其所编码aystrophin蛋白的认识不断深入,探索更简便、准确、经济的基因突变检测技术成为目前对DMD研究的热点,本文着重对DMD基因、突变与表型关系的研究进展,以及突变检测技术的进展做一综述。     

基因枪转导K-RAS反义基因对胰腺癌细胞(K-RAS P21)蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RAS P21蛋白的影响。方法利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过免疫细胞化学和Western blot方法,观察K-RAS突变特异性反义基因转导后AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RAS P21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后,AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达明显降低;BxPC-3胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后,可用于胰腺癌的治疗。     

基因枪转导K-RLIS反义基因对胰腺癌细胞（K-PLASP21）蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RASP21蛋白的影响。方法利用基因枪技术，将反义基因转导入宿主细胞，通过免疫细胞化学和Westernblot方法，观察K-RAS突变特异性反义基因转导后ASPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RASP21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后，AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达明显降低；BxPC-3胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后，可用于胰腺癌的治疗。     

降钙素基因的化学合成与克隆

本文报道用化学法全合成降钙素的基因。基因全长113碱基对。采用大肠杆菌偏爱密码子。整个基因分为6个片段合成。用T~4DNA连接酶一次连接成功,序列分析证明合成的基因序列与设计的一致。     

Phylogeny of Thogoto Virus

Thogoto virus is a tick-borne member of the family Orthomyxoviridae. Previously, based on the similarity in antigenic relationship by cross-neutralization test, all virus strains were concluded to have derived from the same origin. In this study, we obtained partial gene sequences of 4 genes (PB1-like protein, PA-like protein, glycoprotein, and nucleoprotein) of 8 Thogoto virus strains isolated in Africa, Asia, and Europe and studied the genetic variation and phylogeny. Unrooted phylogenetic trees created by both neighbor-joining and maximum likelihood methods based on nucleotide and amino acid sequences for 4 genes were mostly similar and revealed two lineages, Euro-Asian and African. Intra-lineage nucleotide sequence variation was greater in the Euro-Asian lineage than in the African lineage for all 4 genes. Furthermore, for the strains of Euro-Asian lineage, variations for two genes associated with RNA-dependent RNA polymerase activities were greater than those for glycoprotein or nucleoprotein gene, based on both nucleotide and amino acid sequence differences as well as on synonymous and nonsynonymous differences, indicating greater mutation rates for the polymerase activity genes in these strains.     

三例眼皮肤白化病患者TYR和P基因的突变分析

目的 分析眼皮肤白化病(oculocutaneom albinism,OCA)患者酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和P基因的基因突变.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)和变性高效液相色谱(de-naturing high-perfomanee liquia chromatography,DHPLC)技术对3例患者的眼皮肤白化病Ⅰ、Ⅱ型相关基因(TYR和P基因)的外显子进行突变检测,并对DHPLC检出的突变样本进行测序和限制性内切酶分析以验证该突变.针对未见报道的新突变,筛查100名表型正常的无关个体,排除多态的可能.结果 在3例患者中检测出两种P基因突变,未检测到TYR基因突变.其中,患者1的P基因第13外显子发生杂合突变T450M;患者2的P基因发生两个杂合突变,分别是第13外显子T450M和第23外显子G775R;患者3的P基因第23外显子发生杂合突变G775R.P基因第13外显子限制性内切酶分析显示,患者1、2均出现杂合突变T450M导致的Oli I酶切位点部分消失,100名表型正常的无关个体未检出该突变;经检索,T450M为一未见报道的新突变.结论 联合应用PCR、DHPLC、DNA测序和限制性内切酶分析的方法可有效的对白化病进行基因诊断.     

人肺癌相关抗原基因ALT04ag的分子克隆及其转化活性的初步研究

本文旨在克隆人肺癌相关抗原基因ALT04ag cDNA全长序列并对其生物信息学特性及转化活性进行初步探讨。采用5'RACE实验程序克隆靶基因全长cDNA，借助生物信息学分析方法对其序列进行初步分析，以细胞生长曲线、FCM分析及RT-PCR技术分别观察重组。ALT04ag表达质粒转染细胞的生长特性及相关基因的表达。结果表明ALT04ag cDNA序列全长1115bp，含有编码194个氨基酸的开放阅读框架，计算预测其分子量为21KD，等电点为5．51。该序列登录Genbank(AF026816)时未发现同源序列(2001-1-30)。该基因转染的细胞有ALT04ag基因表达，ALT04ag基因表达可上调c-myc基因表达及加速细胞增殖速率，但对bcl-2及p53基因表达无影响，提示ALT04ag基因表达可能是细胞癌变的重要因素之一。本研究为探索人肺癌诊断及治疗的分子靶标提供了新的线索。     

原发性肝细胞癌RIT1基因的突变和扩增

目的　探讨 RIT1基因突变和扩增在肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)的发生情况及其与发病的关系。　方法　采用 PCR直接测序法检测 5 0例原发性 HCC患者的肝癌组织和非癌肝组织RIT1基因在所包含的 6个外显子的全序列寻找突变位点 ;并用荧光定量 PCR法检测 RIT1基因的扩增情况。　结果　在 5 0例肝癌组织中 1例出现第 5外显子编码区 2 4 1位核苷酸 G/ C变异 ,其对应密码子改变为GAG81CAG,编码氨基酸改变为 Glu81Gln,该氨基酸变异位于 GTP结合的保守功能域内 ,该病例的非癌肝组织以及其余 4 9例的肝癌组织和非癌肝组织均未发生此种改变 ;在 5 0例肝癌组织和非癌肝组织中均出现 5′- UTR(起始密码子前 2 1位核苷酸 ) G/ C变异 ;在获得有效扩增数据的 4 3例肝细胞癌患者中 ,11例有 2～2 97倍的 RIT1基因扩增 ,扩增率为 2 5 .6 %。　结论　基因扩增是 RIT1基因在肝细胞癌的激活方式之一 ,可能与肝细胞癌的发病有关 ,而点突变方式可能意义不大。     

不同选择剪接形式的小鼠Era在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:对不同剪接形式的小鼠era基因(mera)进行克隆、原核表达,并进行纯化,检测抗人Era蛋白抗体对于两种剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后鼠Era蛋白的研究奠定基础。方法:采用两种剪接形式era基因的MBP融合表达载体(pMAL-meraW,pMAL-meraS),在大肠杆菌中进行表达,对其进行纯化,并应用Westernblot鉴定了抗人Era蛋白抗体的特异性。结果:原核表达的MBP-mEraW、MBP-mEraS融合蛋白经过薄层扫描后发现其分别占菌体总蛋白的17%、19%;纯化后的融合蛋白纯度为67%和61%;用抗人Era蛋白抗体进行Westernblot发现抗体特异性较好,适合两种剪接形式的鼠Era蛋白的检测。结论:利用原核系统高效表达了不同剪切形式的鼠era基因,并检测了兔抗人Era蛋白抗体对不同剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后对鼠era基因的研究奠定了基础。