人白细胞环孢素A亲和素mRNA表达水平的检测

应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,以组成型表达β-Actin为内标,建立了人白细胞中环孢素A亲和素(Cyclophilin,CyP)mRNA表达水平半定量的测定方法,并检测了38例正常人CyP表达水平.     

生物体液中美多洛尔和α-羟基美多尔反相HPLC测定法

建立了以苯基柱为固定相同时测定人血浆、尿液或唾液等生物体液中美多洛尔(M)和α-羟基美多洛尔(α-OHM)的反相离子对HPLC方法,流动相由90％甲醇、10％2.5 mmol/L庚烷磺酸钠水溶液、0.05％乙酸组成,225nm紫外光波检测,以普萘洛尔为内标物,M、α-OHM及内标物均可获峰型尖锐对称之基线分离。在0.5～10μg/ml范围内,M和α-OHM的回收率均≥92％,CV均<     

EV71、CA16及通用型肠道病毒实时荧光定量PCR诊断试剂盒的研发

目的 研制一种新的含竞争性内标引物,能同时检测EV71、CA16及通用型肠道病毒的四重实时荧光定量PCR诊断试剂盒,用于手足口病的临床诊断及流行病学监测.方法 设计特异性的EV71型、CA16型及其他型肠道病毒和内参基因的引物,改进病毒核酸提取方法,优化实时荧光定量PCR检测体系,并研究产品的准确度、稳定性、精密度和扩增效率和检测线性范围.结果 本试剂盒的引物和探针特异性好,试剂盒采用的的病毒RNA抽提效果与QIAGEN公司QIAamp Viral RNAmini Kit抽提效果相当,但具有更低的试剂成本.优化引物探针浓度分别为0.2μmol/L的上下游引物浓度、0.06 μmol/L的通用探针浓度、0.08 μmol/L的EV71分型探针浓度和0.08μmol/L的CA16分型探针浓度.产品具有较好的稳定性和良好的准确度、精密度,CA16、EV71和肠道病毒通用型对引物的扩增效率分别是106％、101％和105％,线性检测范围是109拷贝/μl ～ 102拷贝/μl.结论 采用四重荧光定量PCR技术开发的能同时检测EV71、CA16、其他肠道病毒和内标的手足口病诊断试剂盒具有良好的准确性、稳定性、精密度和扩增效率等,具有很好的临床应用价值.     

顶空气相色谱法检测血液中的乙醇含量

目的 建立顶空气相色谱法检测血液中乙醇含量的检测方法。方法 取0.5 ml待测血样2份加入叔丁醇内标液0.1 ml于20 ml顶空瓶中,顶空进样。在特定的色谱条件下,血中的乙醇能与样品中可能存的主要干扰成分实现分离,阳性对照血中的乙醇、叔丁醇保留时间分别作为对照,以保留时间定性,用内标法以乙醇对内标物的峰面积比进行定量分析。结果 乙醇的保留时间为3.482分,叔丁醇的保留时间为4.394分,相对标准偏差（n=10）均小于5%,该方法检测结果准确。结论 顶空气相色谱法检测血液中的乙醇含量,血样直接顶空进样,不受进样误差干扰,结果稳定,操作方便,分析时间短、线性关系良好、灵敏度高,适用于涉嫌酒驾案件的全血中乙醇含量的测定。     

重组PCR构建bcr—abl mRNA竞争RT—PCR内标物

目的竞争ＰＣＲ可用于ｍＲＮＡ的定量测定，为了得到白血病中ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的竞争内标物。方法利用重组ＰＣＲ技术，实施对ｂ３ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ中一２７６ｂｐ片段的缺失法定点突变。结果经ＤＮＡ序列分析证实，重组后的ｃＤＮＡ片段与重组前相比，５′和３′端大部分序列相同，仅中间５５ｂｐ的部分序列缺失，同时引入１９ｂｐ外源ＤＮＡ片段，即净缺失３６ｂｐ，得到２４０ｂｐ的重组ＰＣＲ产物。较ｂ２ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ相应的２０１ｂｐ扩增片段长３９ｂｐ，使之适于作为ｂ３ａ２和ｂ２ａ２型两类ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的通用内标物。结论表明重组ＰＣＲ是一种获得靶基因的竞争性内标物的简便而可靠的方法     

反相高效液相色谱法监测肾移植病人口服环孢素A的全血浓度及药代动力学

本文报道用反相高效液相色谱法测定肾移植术后病人口服环胞霉素A(CsA)的全血浓度及药代动力学研究。采用yWG—C_(18)(300×4.6mm,10μm)分析柱(柱温65℃),甲醇:异丙醇:0.02％磷酸(68:20: 20)为流动相,环孢霉素D作内标,于215nm波长处检测。CsA的保留时间为5.40min,内标的保留时间为6.20min。     

内皮型一氧化氮合酶基因在大鼠心肌细胞和非心肌细胞中的表达

根据大鼠内应型一氧化氮合酶（eNOS）和3-磷酸甘油醛脱氨酶（GAPDH）的cDNA序列分别设计特异引物,用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测eNOS基因在大鼠心肌细胞和非心肌细胞中的表达,并以GAPDH为内标,用内参比法作RT-PCR定量。结果表明：eNOS基因在新生大鼠心、肾、脑等组织皆有表达,脑中最多、肾脏次之、心脏较少;在培养的新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞中,检测到eNOS基因的表达,其中在心肌细胞的表达高于非心肌细胞;培养基中不同的血清浓度对心肌细胞和非心肌细胞的oNOS基因表达无明显影响。     

SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的制备及样本混检性能分析

目的 开发一种适用于中国大规模人群新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染筛查的核酸检测试剂盒,分析对多样本混合检测的效果,为临床多样本混合检测提供理论指导.方法 选用SARS-CoV-2的ORF1ab、N 2个靶基因,并加入RNase P作为内标基因进行试剂盒研发.采用单一变量及正交实验优化试剂盒中3个靶基因引物及探...     

不孕患者中宫颈HPV高危型别感染率及病毒载量的调查

目的调查高危型人乳头瘤病毒（HPV）在不孕患者宫颈细胞中的感染情况,探讨HPV病毒型别及其载量（viral load）对不孕发生的影响。方法对临床130份不孕患者的宫颈脱落细胞标本和在门诊体检的150份对照组的宫颈脱落细胞标本采用多通道实时荧光定量PCR仪进行八种高危HPvDNA分型及定量检测,该八种高危HPV型别为主要高危型：HPV16,18,45,31和次要高危型HPv33,52,58,67。结果不孕组阳性率为25．38％（33／130）,对照组的阳性率为11．33％（17／150）,两组间的阳性率差异有统计学意义。不孕组的33份阳性标本中病毒载量≥10^6为24例,病毒载量〈10^6为9例;对照组的17份阳性标本中,病毒载量≥10^6为4份,病毒载量〈10^6为13份,两组间的病毒载量有显著性差异。结论不孕组高危型HPV感染率比正常人群（对照组）高。对不孕组病毒载量的分析表明：不孕组人群中其病毒载量明显高于正常人群。此外,本研究还为分泌物核酸检测的定量设置了内标（β-球蛋白）,提出可供临床使用的分泌物取样的核酸定量检测方法。     

定量PCR结合STR多态连锁分析诊断缺失型DMD基因携带者

目的：直接定量PCR结合STR单体型连锁分析，以便更准确检出缺失型家系中DMD基因携带者。方法：在内标引物参照下，PCR扩增22个循环，产物在琼脂糖凝胶分离，EB显色，照相后，扫描定量，同时应用5个STR多态位点的单体型连锁分析，检测缺失型的DMD基因女性携带者。结果：直接定量PCR分析了6个家系中的8个外显子48缺失的DMD母亲或女性同胞，检出7个DMD为携带者；STR多态单体型连锁同样分析这6个家系中的8个女性亲属，亦检出7个DMD基因携带者，二种方法所得结果完全一致。结论：STR多态连锁分析与直接定量PCR法结合，可更准确，全面检出DMD基因携带者。     

大鼠组织中三磷酸肌醇受体亚型基因的表达

目的观察大鼠心肌、小脑和培养的主动脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）中三磷酸肌醇受体（ＩＰ２Ｒ）亚型的基因表达。方法用异硫氰酸胍－酸酚氯仿一步法抽提组织总ＲＮＡ,用特异性引物进行逆转／聚合酶链式反应（ＲＴ—ＰＣＲ）,β－ａｃｔｉｎ为内标半定量检测ＩＰ３Ｒ亚型ｍＲＮＡ的表达。将Ⅱ型ＰＣＲ产物重组、克隆并测序。结果发现ＩＰ３Ｒ三个亚型在心肌、小脑和ＶＳＭＣ中均有表达,小脑组织中表达水平较高。ＰＣＲ扩增片段分别为：Ｉ型ＩＰ３Ｒ,５２５ｂｐ（小脑）或４０５ｂｐ（心肌ＶＳＭＣ）;Ⅱ型ＩＰ３Ｒ,４０５ｂｐ;Ⅲ型ＩＰ３Ｒ,１６９ｂｐ。结论序列分析发现克隆的Ⅱ型ＩＰ３Ｒ ｃＤＮＡ序列与设计的目的 ｃＤＮＡ一致,证实了本文 ＲＴ－ＰＣＲ的特异性和准确性,提示本文所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法能可靠地研究动物组织中ＩＰ３Ｒ不同亚型的基因表达。     

反相高效液相色谱法测定血清中甲硝唑浓度

本文报道用反相高效液相色谱法测定血清中甲硝唑浓度。采用Beckman344系列高效液相色谱仪,包括114型泵,160型固定波长254nm紫外检测器,yWGC_(18)不锈钢分析柱(250±4.6mm,10μm)。以甲醇:水:pH5.0饱和磷酸盐缓冲液(34.5:65:0.5为流动相,流速1.0ml/min,检测器灵敏度置0.005aufs。样品血清200μl,加入内标工作液100μl     

人血浆肌醇气相色谱质谱联用检测方法的优化及应用

目的肌醇(Inositol)缺乏与增加神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)、神经障碍和新陈代谢等疾病风险密切相关。本研究对前期建立的气相色谱质谱(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)联用方法进行优化,建立一种准确、高效、便捷及微量的测定人群血浆肌醇含量的气相色谱质谱联用方法,并应用于临床血浆样本检测。方法本研究优化已建立的检测方法,并用同位素标记法(内标法)验证此方法的准确性。结果与之前已建立的方法相比,这种新方法在血浆检测体积上进行了优化与提升,经过优化后,检测血浆所需体积更小,为30μL;并用同位素标记法(内标法)与已建立的方法进行比较,其结果具有良好的一致性。选取出生缺陷高发地区人群标本40例,其中正常孕妇20例,NTD孕妇20例,包括脊柱裂与无脑畸形各10例,并检测其血浆肌醇水平,发现孕NTDs胎儿孕妇的血浆肌醇水平显著低于同地区对照组(1.87±0.73mg/L2.58±1.10mg/L,P=0.024),其中,脊柱裂组的肌醇水平明显降低(1.68±0.46 mg/L,P=0.033)。结论本文建立了一种准确、高效、便捷及微量的测定人群血浆肌醇含量的气相色谱质谱联用方法,可应用于临床检测,血浆肌醇检测有可能成为一个NTD筛查的标志物,有助于临床诊断及防治与肌醇代谢紊乱相关的疾病。     

高效液相色谱法测定狼疮性肾炎患儿血浆中环磷酰胺的含量

目的 建立测定狼疮性肾炎(LN)患儿血浆中环磷酰胺含量的高效液相色谱(HPLC)方法,为制订个体化治疗方案提供依据.方法 色谱柱为Hypersil ODS-2 C18柱,流动相为乙腈-水(体积比为30:70),流速为1.0 ml/min,柱温为30℃,检测波长为195 nm,进样量为20μl.以异环磷酰胺为内标,血浆样品经甲醇沉淀蛋白、离心取上清液进样检测.结果 血浆中环磷酰胺的质量浓度在0.5～20.0 mg/L范围内,环磷酰胺与内标的峰面积比呈良好的线性(r=0.9994),最低检出限为0.1 mg/L;日内、日间精密度和稳定性实验的相对标准偏差(RSD)均＜8％;加样回收率为100.60％～101.05％,结果满意.结论 该法简便、快速、准确、重现性好,可用于LN患儿血浆中环磷酰胺的含量测定及免疫抑制治疗的临床药学监护.     

高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆盐酸伪麻黄碱浓度

目的 建立一种高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）测定人血浆盐酸伪麻黄碱浓度的方法。方法 血浆样品经液液萃取后,以甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1,V/V/V）为流动相,流速0.35 ml/min,采用Cap cell pack C18色谱柱分离,150 mm×2.1 mm, 5 μm（USA）;柱温20℃,选择离子喷雾离子化源串联质谱,通过正离子方式检测;选择反应监测（MRM）方式转化m/z=166.3/148.2（盐酸伪麻黄碱）和m/z= 152.2/134.15（内标苯丙醇胺）进行定量分析,用内标法测定含量。结果 伪麻黄碱浓度分别在5.0~400.0 ng/ml的范围内线性良好,R=0.9962,最低检测限为1.0 g/ml。结论 本方法操作简便、快速,结果准确,可用于该药物的含量测定,同时也可为临床药动学研究提供一定的参考。     

脊髓性肌萎缩症SMN基因拷贝数定量分析

目的　探讨临床诊断为脊髓性肌萎缩症 (spinal muscular atrophy,SMA)而 PCR定性无运动神经元生存 (survival motor neuron,SMN )基因 T拷贝 (SMN - T)缺失患者的遗传基础 ;并探索 SMA表型与SMN基因 C(SMN- C)拷贝数的关系及 SMA患者及其直系亲属和正常人 SMN基因拷贝数的分布。方法对临床和病理诊断为 SMA ～ 型及少见型 4 5例患者、2 5名表型正常的 SMA直系亲属进行 SMN- T和SMN- C基因拷贝数定量分析 ,并与 33名正常人进行对比 ;所有对象均已经 PCR Dra 酶切法定性检测SMN基因 ,其中 ～ 型的 7例和 型的 2例为 SMN- T纯合缺失 ,余者无缺失。建立 SMN- T和囊性纤维化跨膜调节因子 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)的内标 ,所有标本进行非放射性、非荧光标记的多重竞争性 PCR,根据产物 SMN- T/ CFTR和 SMN- C/ CFTR比值 ,计算 SMN- T和SMN - C拷贝数。结果　 7例 ～ 型 SMN - T拷贝数均为 0 ; 型 2例拷贝数为 0 ,2例为 1个拷贝数 ,系杂合缺失 ,4例为 2个拷贝 ; 型及其他型患者均为 2个拷贝 ;直系亲属中 9例为 1个拷贝 ,系杂合缺失 ,其余及正常对照组均为 2个拷贝。SMN - C拷贝数在 SMA 型为≤ 2 , ～ 型为≤ 3, 型及其它型 SMA、直系亲属和正常对照组均为 0～ 3。结     

实时荧光PCR法检测HER2基因扩增方法的建立

目的探讨应用双标准曲线的实时荧光PCR法检测原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER2）基因扩增在临床乳腺癌诊治中的可行性。方法收集500例乳腺癌术后新鲜组织标本,抽提组织DNA进行实时荧光PCR检测,采用双标准曲线法定量,通过计算目的基因浓度和内标基因浓度的比值来判断HER2基因的扩增情况。选择灵敏度和特异度均较高的荧光原位杂交方法作为对照方法。结果检测阳性标本72例,阴性样本419例。该方法检测的灵敏度为85.9%,特异度为98.79%,准确度为96.74。与荧光原位杂交法（FISH）检测结果相比,二者具有较好的一致性。结论双标准曲线的实时荧光PCR法用于检测HER2基因扩增相对准确可靠,有较好的临床应用前景。     

液相串联质谱在遗传代谢病高危新生儿检测中运用研究

目的研究液相串联质谱在遗传代谢病高危新生儿检测中的意义。方法留取560例临床疑似遗传代谢病新生儿的干血滤纸片,经含氨基酸、酰基肉碱内标的甲醇萃取,盐酸正丁醇衍生后,进行液相串联质谱分析。结果560例高危新生儿中检测出患儿48例,阳性率8．6％（48／560）,包括脂肪酸代谢病11例（22．9％）;氨基酸代谢病15例（31．3％）;有机酸代谢病22例（45．8％）。结论液相串联质谱可以通过检测血滤纸片中的不同酰基肉碱浓度,一次分析快速检测30多种遗传代谢病,对于遗传代谢病高危新生儿的临床诊断具有重要的价值。     

戊型肝炎多重诊断模式的研究

目的探索一种基于ELISA和核酸定性检测技术的戊型肝炎多重诊断模式。方法对261份血清标本采用ELISA技术检测血清戊型肝炎病毒IgM抗体,采用巢式PCR技术对血清中戊型肝炎病毒核酸定性检测。结果 2份血清标本IgM抗体检测呈弱阳性和核酸检测均呈阳性,阳性率为1.0%。结论戊型肝炎病毒IgM抗体和核酸检测相结合的方法有助于戊型肝炎早期诊断和传染风险性评估。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型。方法选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针。评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测。结果20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性。梯度检测的变异系数均小于5％。对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达10^3 eopies／ml。结论本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定。