同源异型盒基因Msx—1在小鼠牙齿发育生物矿化过程中的表达研究

目的：研究同源异型盒基因Msx-1在牙齿硬组织形成过程中的表达和意义。方法：采用原位杂交技术检测Msx-1mRNA在出生后1天、7天和14天昆明小鼠磨牙和切牙牙轴质和牙本质形成 的表达。结果：磨牙中,Msx-1mRNA主要表达于生后1天到7天正在极化的前成轴细胞和前成牙本质细胞,处于分泌期的成釉细胞和成牙本质细胞,7天时信号最强;随后其表达随细胞分化的成熟和牙釉质、牙本质基质形成的进展而逐渐下降。切牙中,牙冠部细胞中的表达与磨牙基本相似;但根部分唇则未分化的颈环上皮和外胚间充质细胞始终呈Msx-1阳性表达,结论同源异型盒基因Msx-1转录主要发生于硬组织形成早期阶段,即成釉细胞和成牙本质细胞的极化和分泌阶段,提示Msx-1可能与了小鼠牙胚硬组织形成过程中细胞分化和生物矿化。     

同源盒蛋白Msx1在骨形成蛋白-4成骨效应中的作用

目的:研究同源盒蛋白Msx1在骨形成蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP-4)成骨效应中的作用,并探讨Msx1与BMP-4的调控关系。方法:体外培养成纤维细胞C2C12,BMP-4处理C2C12细胞24h和36h后,用携带Msx1基因的腺病毒转染C2C12细胞,过度表达同源盒蛋白Msx1,4d后检测细胞中碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的活性,单独用BMP-4处理组和BMP-4连同空白腺病毒组为对照组,未用BMP-4处理组为阴性对照组。结果:在BMP-4处理24h后,Msx1腺病毒转染的细胞ALP活性非常低,而BMP-4处理36h后,Msx1腺病毒转染的细胞显示强ALP活性,单独用BMP-4处理和BMP-4连同空白腺病毒处理的细胞同样显示强ALP活性。结论:同源盒蛋白Msx1能抑制BMP-4的成骨效应,且具有一定的时段特性。     

同源盒基因Msx2在小鼠磨牙牙根发育早期的表达

目的:观察在小鼠的牙根发育早期同源盒基因Msx2的表达,以探讨其在此过程中所起的作用.方法:出生后第6天和第8天的小鼠,取含有下颌第一磨牙的下颌骨,进行固定和脱钙,制备5 μm的石蜡切片,原位杂交方法检测Msx2在小鼠牙根发育早期的表达.结果:第6天Msx2阳性信号出现在Hertwig's上皮根鞘细胞、上皮根鞘周围的牙乳头细胞和早期的成牙本质细胞中;第8天在Hertwig's上皮根鞘细胞、上皮根鞘周围的牙乳头细胞和成牙本质细胞中Msx2有阳性信号,而在成牙骨质细胞中无表达.结论:Msx2参与调控牙根早期发育的生理过程.     

釉基质蛋白对成骨细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原合成的影响

目的观察釉基质蛋白(EMPs)对成骨细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原合成的影响,进一步探讨EMPs促进牙槽骨再生的机制.方法体外培养MC3T3-E1成骨细胞,在培养液中加入不同浓度的EMPs,用酶动力学方法和MTT法作碱性磷酸酶(ALP)比活性测定,同位素掺入结合细菌胶原酶消化法测定Ⅰ型胶原的合成.结果EMPs能明显促进MC3T3-E1成骨细胞的碱性磷酸酶合成以及Ⅰ型胶原合成.结论EMPs对成骨细胞的生物学活性有明显促进作用,提示这可能是EMPs促进牙槽骨再生的一个重要原因.     

釉基质蛋白对成骨细胞碱性磷酸酶和I型胶原合成的影响

目的 :观察釉基质蛋白 (EMPs)对成骨细胞碱性磷酸酶和I型胶原合成的影响 ,进一步探讨EMPs促进牙槽骨再生的机制。方法 :体外培养MC3T3 E1成骨细胞 ,在培养液中加入不同浓度的EMPs ,用酶动力学方法和MTT法作碱性磷酸酶 (ALP)比活性测定 ,同位素掺入结合细菌胶原酶消化法测定I型胶原的合成。结果 :EMPs能明显促进MC3T3 E1成骨细胞的碱性磷酸酶合成以及I型胶原合成。结论 :EMPs对成骨细胞的生物学活性有明显促进作用 ,提示这可能是EMPs促进牙槽骨再生的一个重要原因     

同源异型盒基因Msx-1,Msx-2在鼠牙发育中的表达

目的 观察和比较同源异型盒基因Msx-1,Msx-2 mRNA在牙齿硬组织形成过程中的表达特点,以探讨二者在该病过程中的作用与关系。方法 采用逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术,检测Msx-1,Msx-2mRNA在1、3、7和14d龄的昆明小鼠磨牙牙胚中的表达。结果 Msx-1,Msx-2在牙胚硬组织形成主要阶段均有表达,并随细胞分化、基质分泌和矿化的进展呈现规律性互补表达方式。Msx-1 mRNA在1d龄小鼠牙胚中已有微弱表达,经3、7d表达量逐渐增加,14d龄时表达最强,主要表达于基质分泌和矿化阶段;而Msx-2 mRNA在1d鼠牙胚中表达极弱,3d龄时表达最强,经7、14d表达逐渐减弱,主要表达于细胞分化和基质分泌阶段;二者在硬组织形成过程中存在表达量上的规律性互补现象。结论 同源异型盒基因Msx-1,Msx-2在小鼠牙胚硬组织形成过程中均发挥作用;并且其表达量随细胞分化、基质分泌和钙化过程的进展所呈现的规律性互补变化,提示它们之间可能存在功能冗余,即在该过程中二者之间的功能可以相互补充。     

非综合征性唇腭裂与同源异型盒基因1多态性的相关性研究

目的采用聚合酶链反应- 单链构象多态性（PCR- SSCP）方法研究同源异型盒基因（MSX）1外显子1的编码区，探讨非综合征性唇腭裂（NSCL/P）患者MSX1基因外显子1的编码区内是否存在基因突变。方法采用聚合酶链反应（PCR）和单链构象多态性（SSCP）方法，以45名健康人为对照组，45名NSCL/P患者作为研究对象，分析MSX1基因多态性。结果SSCP分析显示NSCL/P患者（45名）与对照组（45名）样本的电泳速率相同，提示无多态性存在。结论MSX1基因外显子1未发现多态性的存在，其与NSCL/P患者之间无明显相关性。     

人涎腺腺样囊性癌相关同源异型盒基因差异表达的研究

目的研究人涎腺腺样囊性癌及正常腺体中同源异型盒基因的表达差异,认识该基因与涎腺腺样囊性癌发生发展的关系。方法设立6组严格配对的腺样囊性癌/癌旁腺体标本及2组腺样囊性癌细胞株/癌旁腺体标本,采用定制的含232条人类同源异型盒基因探针的Oligo芯片进行分析,归纳2组间差异基因信息。荧光实时定量PCR技术检测高度可疑的涎腺腺样囊性癌相关基因在不同样本中的mRNA表达水平,统计学分析找出明显异常表达的同源异型盒基因。结果组织样本出现上调的同源异型盒基因67条,下调基因54条;细胞样本中出现上调的同源异型盒基因12条,下调基因15条;同时出现在组织及细胞样本中的上调基因1条（TGIF）;下调基因7条,出现频数较高的为EVX1、PITX1。荧光实时定量PCR检测显示TGIF、EVX1在ACC-M与正常腺体组织的表达量有统计学差异。结论同源异型盒基因作为细胞正常增殖和分化的关键基因,可能与涎腺腺样囊性癌形成过程密切相关。     

机械牵张力对成骨细胞碱性磷酸酶及骨钙蛋白的影响

目的:研究不同大小的机械牵张力对成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙蛋白(OCN)的影响。方法:通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1同时施加6%、12%和18%的机械牵张力,作用24 h和48 h后,用ALP试剂盒检测细胞受力后ALP的变化、用放射免疫的方法检测OCN表达的变化(P<0.01)。结果:细胞受力后,其ALP活性随牵张力值的增大明显降低(P<0.01);12%牵张力可使OCN的表达明显增加,而6%、18%牵张力组和对照组比较,无显著性差异(P>0.05)。结论:不同大小的机械牵张力可以影响成骨细胞的ALP活性及OCN的表达,与力值大小密切相关。     

碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞骨架蛋白作用的研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成骨细胞骨架蛋白的作用。方法用含不同浓度bFGF F12培养基对成骨细胞进行24 h预孵后,将成骨细胞接种于喷砂处理的钛片上,第3天终止培养,利用激光共聚焦显微镜以及免疫荧光的方法对细胞骨架进行形态学观察以及荧光定量检测。结果成骨细胞中的微丝骨架呈纤维状,以与细胞长轴平行的方向排列。9 ng/mL和27 ng/mL bFGF预孵成骨细胞,能增加成骨细胞中细胞微丝骨架蛋白F-actin的含量。结论一定浓度的bFGF能促进成骨细胞骨架蛋白的表达。     

降钙素基因相关肽对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用研究

目的 探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用及其潜在机制。方法1）构建细胞氧化损伤模型,将实验分为4组,H₂O₂组使用含不同浓度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5 mol·L^-1）H₂O₂的培养液,CGRP+H₂O₂组使用含不同浓度（10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10 mol·L^-1）CGRP的培养液预处理后再加入含10^-4 mol·L^-1 H₂O₂的培养液,对照组为常规培养液,空白组不接种细胞。培养12、24、36、48 h后,CCK-8法检测细胞增殖活性,筛选最佳建模浓度和CGRP对成骨细胞氧化损伤的最佳保护浓度。2）采用含10^-4 mol·L^-1 H₂O₂（H₂O₂组）、10^-8 mol·L^-1 CGRP（CGRP组）的培养液和10^-8 mol·L^-1 CGRP+10^-4 mol·L^-1 H₂O₂培养液（CGRP+H₂O₂组）、常规培养液（对照组）培养成骨细胞,测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性、活性氧（ROS）的含量以及炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。结果 1）在10^-4 mol·L^-1 H²O²时细胞增殖开始出现抑制（P<0.01）,并呈浓度和时间依赖性;10^-8 mol·L^-1 CGRP预处理后细胞增殖活性最高,与只加入10^-4 mol·L^-1 H₂O₂有统计学差异（P<0.01）。2）与H²O²组相比,CGRP+H₂O₂组SOD活性升高（P<0.01）,TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P<0.05）,ROS含量降低（P<0.01）。结论 H₂O₂会对MC3T3-E1成骨细胞造成氧化损伤,CGRP对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤具有保护作用。     

PP-1蛋白稳定高表达MC3T3-E1成骨样细胞系的建立

目的建立稳定高表达蛋白质磷酸酶-1(protein phasphatase-1,PP-1)的MC3T3-E1成骨样细胞系。方法采用RT-PCR技术从MC3T3-E1细胞中扩增蛋白质磷酸酶-1(PP-1)基因,将获得的基因定向插入pCI-neo真核表达质粒中,PCR及双酶切鉴定后用脂质体将表达载体转染入MC3T3-E1细胞,经G418加压有限稀释筛选,建立稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,采用Western blot法检测PP-1的蛋白表达情况。结果 PCR及双酶切鉴定表明表达载体pCI-neo-PP-1构建正确;Western blot检测结果显示PP-1蛋白能在转染pCI-neo-PP-1的MC3T3-E1细胞中稳定高表达。结论成功建立了稳定高表达PP-1的MC3T3-E1成骨样细胞系,为进一步深入研究PP-1在细胞力学信号转导通路中的功能及作用机制奠定了实验基础。     

骨形态发生蛋白7在高糖环境下对成骨细胞分化的影响

目的:研究对于重组人骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)在持续稳定高糖环境下对成骨细胞生物学性能及成骨活性的影响。方法:细胞取小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1Subclone 14,MC3T3),分为4组:正常生理糖浓度组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)为对照组,生理糖浓度+BMP7组高糖组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)(葡萄糖浓度为25 mmol/L),高糖+BMP7组(葡萄糖浓度为25 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同条件培养后1 d、3 d、5 d、7 d后的细胞增殖情况,成骨诱导检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。罗丹明-鬼笔环肽染色后以激光共聚焦显微镜观察MC3T3细胞骨架于BMP7作用24h后的形态变化,荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测BMP7作用48 h后成骨基因特异性转录因子2(Runx2),骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达。结果:MTT实验显示25 mmol/L葡萄糖可抑制MC3T3增殖(P<0.05),加入BMP7后可提高细胞增值率(P<0.05)。并可上调高糖导致的ALP活性下降。细胞骨架观察结果显示,对照组细胞骨架成束状铺开,交织成网,较为均匀。高糖组细胞微丝解聚成团状,模糊不清。RT-qPCR结果显示BMP7可促进MC3T3细胞的ALP、OCN及Runx2(P<0.05)的表达。结论:持续稳定高糖环境能够抑制成骨细胞的增殖及ALP活性,影响细胞骨架结构,抑制成骨基因表达,添加BMP7可以在不同程度上反转该趋势,但仍较正常水平低。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

成骨细胞中Runx2对机械离心力刺激的响应

目的研究机械离心力刺激对MC3T3-E1细胞中Runx2表达的影响,探讨成骨细胞将力学刺激转化为生化响应过程中骨形态发生蛋白（BMP）信号转导通路的作用。方法将MC3T3-E1细胞分成A、B、C、D组,分别使用含10%胎牛血清、10%胎牛血清、100 ng·mL-1 Noggin和100 ng·mL-1 Noggin的DEME培养基预处理24 h,对B、D组加载271×g离心力5 min,A、C组不进行离心加力,其余条件相同。30 min后4组分别同时收获细胞,提取总RNA,并逆转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测Runx2基因表达情况。结果B组Runx2 mRNA表达较A组明显增高（P<0.05）,D组Runx2 mRNA表达比B组表达明显降低（P<0.05）,A、C、D组间表达水平比较差异无统计学意义（P=0.692）。结论BMP信号转导通路参与成骨细胞对机械离心力刺激的响应过程,并可能在成骨细胞对力学信号引起的信息传递级联反应中扮演重要角色。     

联合应用胰岛素样生长因子-I和骨形成蛋白-2促小鼠成骨样细胞及成纤维细胞增殖和分化的效应

目的探讨重组人胰岛素样生长因子-I(rhIGF-I)和重 组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)单独及联合应用对MC3T3-E1和NIH3T3细胞增殖和分化的影响。方法单独或联合应用不同浓度rhIGF-I 和rhBMP-2作用于MC3T3-E1和NIH3T3细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞分化 情况,放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素(OC)水平。结果1～75ng/mlrhIGF-I与10～100ng/mlrhBMP-2作用于MC3T3- E1和NIH3T3细胞后,均能显示明显的促细胞增殖(P<0.01)及使ALP活性增高(P<0.05)的作用。各浓度rhIGF-I或 rhBMP-2对MC3T3-E1及NIH3T3细胞作用8、24和48h的MTT检测结果相似。rhIGF-I和rhBMP-2联合作用后,对两种细胞 的促增殖、增强ALP活性的作用均较各自单独作用更为明显(P<0.05)。单独或联合应用不同浓度rhIGF-I和rhBMP-2对细胞分泌的 OC水平均无显著影响(P>0.05)。结论rhIGF-I和rhBMP-2具有明显的促细胞增殖及早期分化的协同作用,但对成骨末期细胞分化影响 不大,其活性主要与使用剂量有关。     

MC3T3-E1细胞流体剪切力敏感信号通路的基因芯片研究

目的 探讨适宜流体剪切力力值及作用时间下成骨细胞差异表达基因及相关信号通路。方法 通过平行板流室加力装置对盖玻片培养的MC3T3-E1细胞施加流体剪切力,提取总RNA,进行包括44 170个基因的全功能组表达谱基因芯片检测,对差异表达基因进行Pathway和GO分析,并采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）RTPCR）对芯片结果进行验证。结果 芯片结果显示,差异基因共有884个,其中表达增强基因444个,表达降低基因440个。Pathway分析涉及的信号通路,主要包括Notch信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等。GO分析主要涉及前列腺素的生物合成、一氧化氮介导的信号传导、钙介导的信号及细胞免疫反应等不同的功能分类。结论 流体剪切力对MC3T3-E1细胞的保护作用可能与激活促进细胞生存及抑制细胞凋亡相关信号通路及生物学过程相关。