再细胞化牛心包纤维支架试片体内移植:1年的动物实验研究(英文)

目的进一步观察移植后内皮细胞（EC）抗切应力和抗钙化能力以及肌成纤维细胞迁移和自身修复能力。方法新鲜牛心包片经脱细胞、鞣制、改性后备用；A、B组试片上依序种植宿主肌成纤维细胞和EC，C组试片上不种植细胞，随后将3组试片分别移植于猪的腹主动脉壁上；2个月后对A组试片，12个月后对B、C组试片进行厚度、钙含量、扫描电镜及组织学的检测。结果A、B组试片钙含量显著低于C组（P〈0．05），但显著高于新鲜牛心包（P〈0．05）；A、B组试片钙含量差异无显著性（P〉0．05）；A、B组试片显著厚于C组试片（P〈0.05），A、B组试片的厚度差异无显著性（P〉0．05）；B组试片80％～90％的表面覆盖EC，肌成纤维细胞已迁移至表层下支架的3／4；C组试片表面无细胞，肌成纤维细胞已迁移至表层下支架的1／4～1／3，大部分胶原纤维间隙消失。结论人工EC化使生物材料抗钙化能力增强；种植肌成纤维细胞使生物材料具有自身修复能力。但增厚的瓣叶是否影响其功能，尚有待进一步研究。     

京尼平与戊二醛鞣制牛心包材料的对比研究

目的观察京尼平作为一种新型固定生物瓣膜组织交联剂的可行性。方法牛心包经脱细胞处理,分别用戊二醛和京尼平进行鞣制,光镜下观察脱细胞效果,电镜下观察胶原纤维排列;测试收缩温度;拉伸试验测定最大载荷;Wistar大鼠臀大肌皮下埋藏牛心包片,于4周及8周后取出,分别测试京尼平与戊二醛鞣制的牛心包的钙、磷含量。结果经脱细胞处理后,光镜下可见脱细胞处理的牛心包几乎没有细胞核,而未经脱细胞处理的牛心包可见弥漫存在的细胞核。电镜下可见京尼平鞣制的牛心包胶原纤维呈环状交联,戊二醛鞣制的牛心包胶原纤维呈网状交联,京尼平鞣制的牛心包胶原纤维排列较戊二醛鞣制的牛心包略为疏松,收缩温度略低于戊二醛鞣制的牛心包(P<0.05)。最大载荷无统计学差异(P>0.05)。但京尼平鞣制牛心包的钙、磷含量显著低于戊二醛鞣制的牛心包(P<0.05)。京尼平鞣制的牛心包8周的钙含量显著低于4周的钙含量(P<0.05)。结论京尼平鞣制的牛心包具有较高的强度和极低的钙、磷含量,且随时间延长京尼平鞣制的牛心包的钙含量有减少趋势,提示京尼平是一种很有前景的生物组织交联试剂。     

混合醇改性处理对戊二醛牛心包细胞毒性的影响

目的研究混合醇改性对戊二醛牛心包细胞毒性的影响;并验证0.3%戊二醛保存对改性后的戊二醛牛心包细胞毒性有无影响。方法取新鲜牛心包心前区部分,分三组处理:A组:用0.625%戊二醛固定两周后用0.3%戊二醛保存;B组:牛心包用0.625%戊二醛固定二周后,用混合醇后处理并保存;C组:将B组心包在混合醇中处理2个月后,转入0.3%戊二醛中保存。D组:用玻片作为对照组。将三种心包切成同样大小(2×2cm2),用生理盐水分别漂洗10min3次。然后分别种植同样数目的(4×104)人胚肺成纤维细胞,培养7d后,将细胞洗下来,0.4%台盼兰染色,计算每片心包上的活细胞数。同时对心包片细胞作光镜及扫描电镜(SEM)观察。结果4个组活细胞计数结果:三组心包片上的活细胞数分别为:A组(戊二醛牛心包)(:5.83±2.04)×103;B组(混合醇改性戊二醛牛心包)(:16.67±2.04)×103;C组(0.3%戊二醛保存的混合醇改性牛心包):(18.75±1.12)×103。与对照组([176.25±18.15)×103]相比,三种心包均对细胞增殖有不同程度的抑制。混合醇改性后(B、C组)与未改性戊二醛牛心包(A组)的活细胞数有显著性差异(P<0.001),而B组与C组无显著性差异(P>0.05);光镜细胞形态学观察:对照组细胞生长良好,且形态正常,无死亡细胞。细胞计数时见A、B、C三组均有死亡细胞,尤以A组最多;扫描电镜观察:A组细胞较少,且多为圆球形细胞,大部分为裸露的胶原纤维;B、C组均有较多的细胞覆盖生长,细胞展开,可见细胞分裂相。结论经混合醇处理后的戊二醛牛心包细胞毒性明显降低,但仍有细胞毒性;混合醇改性后的戊二醛牛心包保存在0.3%戊二醛溶液中,其细胞毒性无明显改变。     

戊二醛鞣制驴心包与牛心包的体外力学性能比较

目的探讨驴心包在力学性能方面是否符合生物瓣膜的制备条件。方法用戊二醛鞣制脱细胞处理后的驴心包和牛心包进行对比研究。光镜下观察两组脱细胞效果。力学实验测定两组收缩温度、心包厚度、最大载荷、抗拉强度和撕裂强度。结果脱细胞处理后,光镜下见戊二醛鞣制的驴心包和牛心包无残存的细胞核,而未经脱细胞处理的驴心包和牛心包可见弥漫性细胞核存在,两种心包无明显差异;驴心包组收缩温度(87.500 0±0.591 6)℃,牛心包组收缩温度为(87.560 0±0.371 5)℃,两组差异无统计学意义(P>0.05);取相同心尖部位的驴心包与牛心包比较,驴心包厚度薄,抗拉强度大(P<0.001);两者的最大载荷和撕裂强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论戊二醛鞣制的驴心包在力学性能方面适合制作心脏瓣膜材料。     

混合二元醇改性处理对减轻戊二醛牛心包细胞毒性的作用

目的:研究混合二元醇对减轻戊二醛牛心包细胞毒性的作用.方法:牛心包分两组--A组:用0.625%戊二醛固定2 w后用0.3%戊二醛保存;B组:牛心包用0.625%戊二醛固定2 w后,用混合二元醇后处理并保存.C组:玻片对照组.二组心包均切成2 cm×2 cm,分别种植同样数目的(4×104)人胚肺成纤维细胞,培养7 d后,分别计算每片心包上活细胞数.同时作光镜及扫描电镜观察.结果:①活细胞计数结果:A组、B组与对照组相比差异均有显著性(P＜0.01).B组与A组的活细胞数差异有显著性(P＜0.01).②光镜下:对照组细胞生长良好,A、B组均有死亡细胞,尤以A组为多.③扫描电镜:A组活细胞很少,且多为圆球形细胞;B组有较多的细胞覆盖生长,可见细胞分裂相.结论:混合二元醇改性处理后的戊二醛牛心包细胞毒性明显降低.     

戊二醛联合丹宁酸处理增加去细胞牛心包的组织稳定性的实验研究

目的初步观察戊二醛联合丹宁酸处理对去细胞后牛心包组织稳定性的影响。方法新鲜牛心包切割成同样大小的试片数块,分为4组,A组：新鲜牛心包;B组：新鲜牛心包去细胞处理;C组：牛心包去细胞后丹宁酸处理;D组：牛心包去细胞后戊二醛联合丹宁酸处理。通过测定各组试片的厚度、热皱缩温度、抗拉负荷、抗张强度、断裂伸长率及抗胶原蛋白酶降解试验来比较各组的组织稳定性并行形态学和组织学观察。结果 D组在厚度、热皱缩温度、抗拉负荷、抗张强度及抗胶原纤维酶降解能力方面均高于B组（P〈0.05）,组织学发现D组纤维排列较B组更加紧凑。结论戊二醛联合丹宁酸处理能够增加去细胞后牛心包的组织稳定性。     

生物瓣材料体外人工内皮化的实验研究

目的 :探索一种有效的生物瓣材料内皮化方法 ,延长生物瓣的使用寿命。方法 :新鲜牛心包片分三组处理 :Ⅰ组单纯戊二醛 (GA)处理 ;Ⅱ组GA +2 ,3 丁二醇改性 ;Ⅲ组GA +2 ,3 丁二醇改性 +Ⅰ型胶原蛋白预覆 ;空白玻片作对照 (Ⅳ组 )。各组体外种植内皮细胞 ,计算种植后第 1、3、5、8d的活细胞数。种植后第 8d行第Ⅷ因子检测和扫描电镜 (SEM )观察。结果 :Ⅲ组牛心包片表面细胞生长最为活跃 ,在第 5、8d的细胞数明显多于Ⅰ组和Ⅱ组 (P<0 .0 5 ) ,细胞与基质间有微丝连接形成。结论 :2 ,3 丁二醇改性和预覆Ⅰ型胶原蛋白是生物瓣材料体外人工内皮化的有效和可行的方法 ,具有潜在的临床应用前景。     

辛醇对戊二醛鞣制的牛心包抗钙化改性的实验研究

目的:探索戊二醛鞣制牛心包生物瓣膜新的处理方法,以延缓其钙化进程,从而延长牛心包生物瓣使用寿命。方法:用辛醇对戊二醛鞣制的牛心包进行改性处理,通过建立大鼠皮下包埋动物模型加速体内钙化的实验方法;应用原子吸收光谱法测定组织钙含量,以评价辛醇化学改性对戊二醛鞣制的牛心包钙化的影响。结果:辛醇组和戊二醛牛心包钙含量分别为(113．19±14．86)μg／mg和(256．16±21．52)μg／mg(P< 0．001),辛醇组牛心包试片钙含量明显低于戊二醛组。结论:在戊二醛鞣制的基础上通过辛醇对牛心包进行进一步的化学玫性处理,可显著延缓牛心包的钙化进程,可望成为一种增强牛心包生物瓣耐久性的有效方法。     

京尼平交联的脱细胞牛心包生物支架材料的实验研究

目的：初步探讨新型生物交联剂京尼平对脱细胞牛心包基质作为支架材料的影响及意义,为心肌组织工程心脏补片的构建提供较理想的生物支架材料。方法：实验分为三组,A组（25块）为新鲜未脱牛心包组织,B组（25块）为脱细胞牛心包组织,C组（25块）为京尼平交联的脱细胞牛心包组织。采用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;以组织厚度、热皱缩温度和抗拉力测试观察基质的物理性能变化。结果：光学显微镜、扫描电镜观察显示去污剂-酶消化法去细胞百分率达98.63%,能够有效脱除细胞,完整保留牛心包组织的胶原纤维和弹力纤维;组织厚度测试结果为,A组（3.8±1.0）mm,B组（3.8±1.2）mm,C组（4.0±1.0）mm;组织热皱缩温度测定结果为,A组（78.50±0.50）℃,B组（67.90±0.60）℃,C组（85.90±0.40）℃;组织抗拉力测试结果显示,经交联剂京尼平处理后C组最大载荷、最大应力、弹性模量、最大应变均高于A组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：经过新型生物交联剂京尼平交联的脱细胞牛心包最大载荷增加显著,可以弥补脱细胞牛心包力学性能的减少,作为较理想的心肌组织工程支架材料。     

动态种植法提高在去细胞猪瓣支架上种植内皮细胞效率和均匀性的研究

目的:尝试使用简单的动态种植方法来提高内皮细胞在去细胞牛心包支架上的种植效率和均匀性,以更有效地构建组织工程瓣膜.方法:采用胰酶-去垢剂法制备去细胞牛心包. 内皮细胞以下列方式在去细胞牛心包支架进行种植和培养: ①振荡种植振荡培养(OO);②振荡种植静止培养(OS);③静止种植静止培养(SS). 定期取样品进行电镜、组织学检测及细胞计数分析. 结果:细胞加入24 h后振荡种植的样品比静止种植的样品细胞在支架内分布更为均匀,同时振荡种植的样品细胞贴壁率[ (36±3) %]高于静止种植的样品细胞贴壁率[(21±2)%, P<0.05]. 振荡种植振荡培养的样品在培养过程中细胞脱离支架而死亡,因此放弃了这些样品的继续培养. 振荡种植静止培养的样品和静止种植静止培养的样品细胞一直保持正常的伸展状态. 在培养过程中支架上的活细胞总数振荡种植静止培养的样品一直高于静止种植静止培养的样品. 结论:采取振荡种植的方式种植细胞可明显提高内皮细胞在三维支架上种植的效率和分布均匀性.     

牛心包脱细胞基质的研制

目的为组织工程学方法研制生物瓣提供适合的基质材料。方法用去污剂-酶联合四步法脱除牛心包组织中的细胞,并对处理后组织的理化性质进行分析、测试。结果脱细胞效果良好,且能较好地保持胶原纤维和弹性纤维的排列分布。脱细胞后的牛心包组织的厚度、抗拉负荷、抗拉强度、断裂伸长率和热皱缩温度无明显变化。组织中可溶性蛋白含量无显著变化,而作为结构成分的胶原蛋白和蛋白聚糖得到了较好的保存。结论去污剂-酶联合四步法能有效地制造牛心包脱细胞基质材料。     

组织工程心脏瓣膜构建中内皮细胞增殖的影响因素

目的:研究影响种植在脱细胞猪主动脉瓣叶上的新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)增殖的因素。方法:以脱细胞猪主动脉瓣叶为支架,在其上种植BAECs。实验分3组:A组单次种植和多次重复(间隔24 h)种植内皮细胞,细胞总数相同;B组细胞培养液含和不含内皮细胞生长物质(ECGS);C组种植前分别以PBS和 FCS预处理12 h;通过细胞计数,观察种植细胞增殖的变化。结果:多次重复连续种植较单次种植的细胞数明显增加(P<0.05);培养液中加ECGS组细胞计数明显比未加ECGS组高(P<0.05);细胞种植前以FCS浸泡者比以PBS浸泡者细胞数增加(P<0.05)。结论:单独种植内皮细胞于脱细胞猪主动脉瓣叶上时,将瓣叶支架以FCS浸泡,培养液中加ECGS,多次重复、间隔24 h种植细胞能明显促进内皮细胞的增殖。     

间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的形态学观察

目的：探讨以间质干细胞（MSC）与同种异体脱钙骨复合培养法构建组织工程化生物衍生骨的可行性。方法：预先制备同种异体脱钙骨，取健康成人骨髓，用单核细胞分离液分离MSC，间充质干细胞基础培养基原代和传代培养。倒置显微镜下观察细胞生物学特性，用FITC标记的抗CD105对第3例细胞进行流式细胞鉴定，并与同种异体脱钙骨复合培养1周后行扫描电镜观察。结果：原代及传代培养的MSC增殖迅速，第3代CD105阳性细胞占64．1％，复合同种异体脱钙骨培养1周后细胞生长状态良好，增殖迅速，在材料表面形成细胞层。结论：未诱导的MSC是骨组织工程适宜的种子细胞，与同种异体脱钙骨复合可作为骨组织工程的载体。     

PVA/ι-CA软骨组织工程支架对ATDC-5细胞生物学行为和组织相容性的影响

目的：探讨PVA/ι-CA软骨组织工程支架对ATDC-5细胞生物学行为的影响,评价其用于构建组织工程软骨的可行性。方法：采用物理共混技术和反复冷冻-解冻方法,将聚乙烯醇（PVA）和卡拉胶按照一定比例制作成复合支架材料PVA/ι-CA并测定其孔径和孔隙率。将ATDC-5细胞接种于支架材料,观察细胞的黏附生长情况;免疫组织化学法和免疫荧光法检测ATDC-5细胞中Ⅱ型胶原的表达情况;甲苯胺蓝检测ATDC-5细胞形态表现;扫描电镜（SEM）下观察细胞生长及细胞外基质（ECM）分泌情况。将ATDC-5细胞分为阴性对照组（加入空白培养液）和实验组（加入含材料的培养液）,MTT法检测支架材料上2组ATDC-5细胞的增殖率。将支架材料植入SD大鼠皮下,评价该支架材料的组织相容性和血管化能力。结果：PVA/ι-CA软骨组织工程支架平均孔隙率为（86.88±3.88）%,平均孔径为20~40 μm。HE染色,ATDC-5细胞在支架材料上贴附生长良好,呈多角形,形态饱满;免疫组织化学和免疫荧光染色,ATDC-5细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白;甲苯胺蓝染色,ATDC-5细胞在支架材料上保持软骨细胞的特性,随着培养时间的延长,支架材料上阳性细胞数量明显增加;ATDC-5细胞与支架材料共培养7 d时,SEM下可见少量细胞呈多角形;培养14 d时细胞数量增多,形态饱满、相互融合,伸入材料间形成锚状结构,牢固地黏附于材料表面;培养21~28 d时材料上附着的细胞分泌大量的ECM包裹材料;ATDC-5细胞在材料上于7~14 d增殖较快,21~28 d增殖较慢,实验组增殖率与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。皮下包埋早期有轻微的炎症反应,随着时间延长而消退;后期有血管化发生,材料降解吸收比较缓慢。结论：PVA/ι-CA支架材料有望成为的软骨组织工程支架材料。     

BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞体外复合培养

目的用生物活性玻璃BG/聚羟基烷酸酯PHBV复合多孔支架材料与骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外复合培养了解其生物相容性,为骨组织工程支架材料选择提供依据。方法:将体外培养的兔骨髓基质细胞诱导分化的成骨细胞,与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增长能力的测定,评价细胞与材料的相容性。结果:骨髓基质细胞有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力成骨细胞与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养8d,分布于支架材料的成骨细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质并形成钙结节。结论:骨髓基质细胞是骨组织种子细胞的良好来源BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞具有良好的生物相容性,是构建组织工程骨的一种理想支架材料。     

改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对成骨细胞增殖效果的比较研究

目的 比较改良贴壁组织块法与改良Ⅰ型胶原酶消法对SD大鼠颞下颌关节髁突软骨下骨成骨细胞的增殖效果.方法 取10只出生1 -3dSD乳鼠颞下颌关节髁突软骨下骨,将骨片平分成2份,分别采用改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消法培养颞下颌关节髁突成骨细胞,并标记为Ⅰ组和Ⅱ组,通过细胞形态学观察、HE染色、ALP染色鉴定成骨细胞.取第4代成骨细胞进行细胞计数、MTT生长曲线及流式细胞仪周期分析,比较2种原代培养方法对成骨细胞增殖能力的异同.结果 （1）Ⅰ组和Ⅱ组培养的细胞经鉴定均为成骨细胞; （2） Ⅱ组成骨细胞总量约为Ⅰ组细胞总量的1.5倍; （3） Ⅱ组成骨细胞MTT生长曲线较Ⅰ组细胞提前2d进入对数生长期及达到生长高峰; （4）2组细胞在达到第4代时,细胞周期含量差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 改良贴壁组织块法和改良Ⅰ型胶原酶消化法均适用于颞下颌关节软骨下骨成骨细胞的培养,但改良Ⅰ型胶原酶消化法可以更快速有效地获得大量成骨细胞.     

间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的形态学观察

目的探讨以间充质干细胞(MSC)与同种异体脱钙骨复合培养法构建组织工程化生物衍生骨的可行性。方法预先制备同种异体脱钙骨,取健康成人骨髓,用单核细胞分离液分离MSC,间充质干细胞基础培养基原代和传代培养。倒置显微镜下观察细胞生物学特性,用FITC标记的抗CD105对第3代细胞进行流式细胞鉴定,并与同种异体脱钙骨复合培养1周后行扫描电镜观察。结果原代及传代培养的MSC增殖迅速,第3代CD105阳性细胞占64.1%,复合同种异体脱钙骨培养1周后细胞生长状态良好,增殖迅速,在材料表面形成细胞层。结论未诱导的MSC是骨组织工程适宜的种子细胞,与同种异体脱钙骨复合可作为骨组织工程的载体。     

内侧隔区预毁损对海马CA1区迟发性神经元死亡的影响

目的 :探讨乙酰胆碱 (ACh)对短暂性全脑缺血再灌后海马CA1区迟发性神经元死亡 (DND)的作用。方法 :46只健康雄性Wistar大鼠随机分为 3组 :Ⅰ 手术对照组 ;Ⅱ MS假性损毁脑缺血再灌组 ;Ⅲ MS预损毁缺血再灌组 ,动物先行MS损毁 ,第 15天再行 4 VO ,使脑缺血 2 0min恢复灌注 72h后取材 ,采用NissleHE和TUNEL染色 ,在光镜下观测计数 ,经统计学处理。结果 :①Ⅱ、Ⅲ组缺血再灌后海马CA1出现迟发性神经元死亡 ;②Ⅲ组较Ⅱ组迟发性神经元损伤明显减轻。结论 :乙酰胆碱参与短暂性全脑缺血再灌后海马CA1区迟发性损伤过程 ,MS预毁损能使死亡细胞明显减少     

钬激光心脏瓣膜去钙化斑块功率的探讨

目的探讨钬激光心脏瓣膜去钙化斑块所需功率的大小。方法收集风湿性心脏瓣膜病患者二尖瓣共30块,按钬激光输出功率及瓣膜病变程度分成3组：Ⅰ组为1~10 w组;Ⅱ组为11~16 w组,再分为2小组：ⅡA组：输出功率为11~12 w（心脏瓣膜以增厚、僵硬为主,钙化不是很明显）;ⅡB组：输出功率为13~16 w（瓣膜以钙化、增厚为主）;Ⅲ组为〉16 w组。每组10块瓣膜。钬激光呈直角扫描照射瓣膜表层来消除钙化斑块及增厚纤维组织。切除激光去钙化斑块前、后的心脏瓣膜各1块行H-E染色和扫描电镜观察,去钙化斑块后的心脏瓣膜行胶原纤维Masson特殊染色。结果 （1）纤维组织增生伴黏液样变性、灶性钙化的瓣膜经钬激光照射后可见灶性钙化基本被消除,瓣膜表面凹凸不平。（2）心脏瓣膜去钙化斑块后热损伤范围Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅲ组比较均有统计学意义（P〈0.05）。（3）心脏瓣膜表面的钙化斑块经激光照射后,Ⅱ组较Ⅰ组、Ⅲ组钙化点清除更彻底,表面更为光整,下层胶原纤维暴露更少。结论 11~16W钬激光输出功率为行心脏瓣膜去钙化斑块是可行、有效的。