层粘连蛋白对体外角膜上皮细胞凋亡的保护

目的 观察层粘连蛋白（ＬＮ）对离体角膜上皮细胞存亡的影响，以寻找预防角膜上皮细胞凋亡的途径。方法 应用流式细胞仪（ＦＡＣＳｔａｒ＾ｐｈｉｓ）检测凋亡细胞的亚２倍体ＤＮＡ的方法，对基础培养的与ＬＮ共育的以及阻断ＬＮ受体的后的兔角膜上皮细胞的凋亡情况进行了对比观察及分析。结果 基础培养的第６代角膜上皮细胞出现明显的细胞凋亡；与ＬＮ共育的角膜上皮细胞凋亡不明显；阻断ＬＮ受体后，角膜上皮细胞显著的凋亡现象     

改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法

目的 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法,提高角膜上皮细胞原代培养的成功率.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞,利用机械刮除和差速贴壁法进行纯化并传代,通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察并应用免疫组织化学的方法对细胞进行鉴定.结果 兔全角膜24 h贴壁,48 h后即可见有细胞自角膜缘爬出,5d后细胞大量爬出可见成纤维细胞和角膜上皮细胞共存,界限明显;角膜上皮细胞复层生长.在界限融合前刮除成纤维细胞,角膜上皮细胞继续旺盛生长,10 d后达到融合.兔角膜上皮细胞传至第4代后细胞体积明显变大,传至第5代,细胞衰老、凋亡.兔角膜上皮细胞免疫组织化学显示PCK单克隆抗体阳性.结论 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法简单、经济、有效,并可获得具有良好生物学特性的角膜上皮细胞,为角膜及角膜疾病的研究奠定实验基础.     

表皮生长因子对不同区域角膜上皮细胞体外传代培养的影响

目的　观察表皮生长因子 (EGF)对角膜上皮细胞体外传代培养的影响。方法　用抗 Brdu抗体标记法 ,流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果　对照组 :中央部细胞传代次数为 ( 5± 1)代 ,周边部的为 ( 7± 1)代 ,角膜缘部的为 ( 8±2 )代。EGF组 :角膜中央及周边部上皮细胞传代次数分别提高 ( 1± 1)及 ( 2± 1)代 ;角膜缘部的增加 ( 5± 1)代。结论　角膜缘细胞在添加EGF后 ,细胞体外传代有显著提高 (P <0 .0 1)。由此提示 :通过进一步改善培养条件 ,体外延长角膜缘部细胞的存活是可能的     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

角膜上皮细胞Pax—6基因表达分析

目的检测体外培养角膜上皮细胞Pax-6基因的表达,探讨维持角膜缘干细胞特性的基因因素.方法地高辛标记cDNA探针进行DNA印迹杂交和蛋白质免疫印迹,检测培养的角膜上皮细胞中Pax-6基因表达状况.结果EcoRⅠ酶切角膜缘上皮细胞中9.1kbp的DNA片断与探针序列相同,其中原位和原代培养细胞、传第l代明显测出,角膜中央上皮细胞的原位和原代细胞中也能测出.Western     

角膜缘上皮细胞分化与增殖及细胞周期素表达

目的:探讨角膜缘上皮细胞分化、增殖能力与细胞周期素D1、E、A表达水平的关系.方法:应用消化培养法分别培养人角膜缘及角膜中央上皮细胞,并将角膜缘上皮细胞传至第3代,将角膜中央上皮细胞传至第1代.分别选用抗细胞周期素D1、E、A的抗体,通过免疫组织化学染色检测各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平.结果:角膜缘上皮原代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平最高,传代培养时细胞周期素的表达水平逐代下降,至第3代已基本上检测不到细胞周期素的表达.角膜中央上皮原代细胞仅极少数表达细胞周期素D1、E、A,传至第1代时已失去表达细胞周期素的能力.各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平与其增殖能力一致.结论:细胞周期素D1、E、A表达水平的高低可反映角膜缘上皮细胞增殖能力的强弱.高度表达细胞周期素D1、E、A的角膜缘上皮细胞可能就是角膜缘干细胞.细胞周期素可能成为干细胞的一种新的免疫学或生化标记.     

体外不同区域角膜上皮细胞对5—FU耐受性的研究

为体外培养角膜上皮移植选取细胞来源，本文应用溴代脱氧尿嘧啶（Ｂｒｄｕ，胸腺嘧啶的类似物）渗入ＤＮＡ合成，抗—Ｂｒｄｕ单克隆荧光抗体标记细胞法，在流式细胞仪（ＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓ）上检测离体情况下兔角膜不同区域上皮细胞对５－ＦＵ耐受情况，以确定长周期细胞的部位。结果显示：经５－ＦＵ处理后的角膜周边及角膜中央部上皮细胞增殖明显受到抑制，而角膜缘细胞对５－ＦＵ毒性则有相对耐受性。由此得出：角膜缘上皮细胞群中有长周期的角膜干细胞存在。因而，行体外培养角膜上皮时，应选取角膜缘部的细胞。     

异体角膜缘上皮细胞培养后移植的实验研究

目的观察含培养的角膜缘上皮细胞的羊膜片移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上的效果。方法把羊膜为载体组织块培养的角膜缘上皮细胞移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上,术后观察角膜混浊度、角膜新生血管、角膜上皮等情况,定期兔进行病理组织学检查。结果角膜缘上皮细胞在羊膜上培养16d形成3～4层,用含有培养的异体角膜上皮细胞的羊膜片移植的12只兔眼,术后第5天,损伤的角膜表面全部上皮化,第16天开始,12只兔眼逐渐出现排斥反应。结论含培养的角膜缘上皮细胞羊膜片异体移植术后早期角膜全部上皮化,晚期则出现排斥反应。     

角膜缘上皮细胞分化与增殖及细胞周期素表达

目的：探讨角膜缘上皮细胞分化、增殖能力与细胞周期素D1、E、A表达水平的关系。方法：应用消化培养法分别培养人角膜缘及角膜中央上皮细胞,并将角膜缘上皮细胞传至第3代,将角膜中央上皮细胞传至第1代。分别选用抗细胞周期素D1、E、A的抗体,通过免疫组织化学染色检测各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平。结果：角膜缘上皮原代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平最高,传代培养时细胞周期素的表达水平逐代下降,至第3代已基本上检测不到细胞周期素的表达。角膜中央上皮原代细胞仅极少数表达细胞周期素D1、E、A,传至第1代时已失去表达细胞周期素的能力。各代细胞表达细胞周期素D1、E、A的水平与其增殖能力一致。结论：细胞周期素D1、E、A表达水平的高低可反映角膜缘上皮细胞增殖能力的强弱。高度表达细胞周期素D1、E、A的角膜缘上皮细胞可能就是角膜缘干细胞。细胞周期素可能成为干细胞的一种新的免疫学或生化标记。