bcl—2基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响

目的：探讨ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响。方法：应用细胞培养，免疫标记及流式细胞仪技术，检测了ｂｃ１－２基因反义寡脱氧核糖核苷酸（ＡＳＯＤＮ）和阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）对白血病Ｋ５６２和ＨＬ－６０细胞作用和ｂｃｌ－２基因表达。结果：Ａｒａ－Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）与ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ同时作用比单独用Ａｒａ－Ｃ或Ａｒａ－Ｃ与正义寡脱氧核糖核苷酸（ＳＯＤＮ）细胞存活率显著减少（Ｐ＜０００１），并且流式细胞仪检测显示ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ使ｂｃｌ－２蛋白阳性率降低。结论：ｂｃｌ－２基因反义寡核苷酸能抑制该基因表达，提高白血病细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性     

hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性影响

目的:检测hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性的影响及其机制。方法:TRAP法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测hTERT蛋白表达,逆转录-多聚酶链式反应检测hTERTmRNA表达。结果:检测端粒酶活性,Jurkat细胞吸光度A值为0.492±0.051,hTERT反义核酸作用48hA值降为0.351±0.051,hTERT反义核酸作用72hA值降为0.238±0.024;检测hTERT蛋白表达,Jurkat细胞hTERT蛋白阳性率89.513%±3.389%,hTERT反义核酸作用48hhTERT蛋白阳性率低至77.237%±2.872%,hTERT反义核酸作用72hhTERT蛋白阳性率低至47.767%±1.326%。而hTERT正义核酸无上述作用。hTERT反义核酸作用Jurkat细胞48h、72h对hTERTmRNA表达无影响。结论:hTERT反义核酸降低Jurkat细胞端粒酶活性,机制可能是降低hTERT蛋白表达量,对hTERTmRNA无影响。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

Bcl-2基因反义核酸增强三氧化二砷对NB4细胞凋亡效应

目的:研究和探索bcl-2基因反义核酸(bcl-2ASODN)是否能提高三氧化二砷(As₂O₃)对NB4白血病细胞的凋亡效应。方法:采用微量细胞培养的方法,观察反义核酸、砷剂单独以及反义核酸、砷剂联合培养NB4细胞的生物效应和凋亡形态变化;用免疫组化的方法,结合流式细胞技术,测定NB4细胞的DNA和Bcl-2蛋白的变化。结果:As₂O₃(0.25μmol/L)+bcl-2ASODN(10.0μmol/L)联合诱导NB4细胞凋亡作用显著强于单用As₂O₃(0.25μmol/L)或bcl-2ASODN(10.0μmol/L)(P＜0.01)。流式细胞仪检测显示,联合用药Bcl-2蛋白表达亦明显少于反义核酸、砷剂单独给药组(P＜0.01)。结论:bcl-2基因反义核酸能明显提高和显著增强As₂O₃对NB4白血病细胞的致凋亡效应。     

反义nov基因对培养神经元神经递质分泌的影响

目的：研究nov基因在神经元功能分化和神经递质分泌中的作用。方法：利用反义核酸技术构建成反义nov基因真核表达载体pBK-nov。采用脂质体转染技术,交坂义表达载体导入培养的大鼠大脑皮质神经元和纹状体神经元,经G418筛选出被转染的神经元继续培养,RT－PCR检测围染后nov mRNA的表达量。采用高效氨基酸分析仪和高效液相色说 ,检测抑制表达后氨基酸类递质和多巴胺类递质的变化。结果：谷氨酸和肾上腺素的分泌量明显下降,γ－氨基酸上升,而对多巴胺的分泌没有显著的影响。结论以上结果提示,nov基因在中枢神经系统神经递质的生成释放和代谢中起作用,可能籍此调节神经系统的功能。     

联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响，探索一种理想的血管再狭窄的疗法。方法：选择20只新西兰家兔，实验组、对照组各10只，均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术，实验组行腺病毒介导的p21 cDNA溶液浸泡和反义c-fos寡聚核苷酸凝胶涂布；对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后2周取出移植血管，分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度（IT）、内膜平滑肌细胞（VSMC）数及PCNA阳性表达情况。结果：实验组移植血管IT、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少，增殖细胞核抗原（PCNA）阳性表达情况亦较对照组明显减少。结论：联合转染p21基因和反义c-fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生。     

hTERT基因反义核酸对化疗药物诱导CEM细胞凋亡的影响

目的：利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制人T淋巴细胞白血病细胞株(CEM)端粒酶活性后，探讨化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对CEM细胞凋亡的影响。方法： 采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对CEM细胞系生长的影响；姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化；通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果： hTERT ASODN作用于CEM细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙，对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比，统计学上无显著差异(P＞0.05)。hTERT反义核酸作用于CEM细胞24 h加入顺铂，再共同作用48 h，CEM活细胞均数为2.318×108 cells/L，与单用顺铂组(3.250×108 cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组(3.175×108 cells/L)相比，对细胞抑制明显增强(P＜0.05)。hTERT ASODN作用于CEM细胞24 h再加入顺铂作用48 h，细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于CEM细胞48 h的凋亡细胞百分率(19.47%)分别同SODN与顺铂联合作用组(6.97%)、单用顺铂作用组(6.02%)进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论： hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导CEM细胞凋亡。     

bcr-ahl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响

目的：研究 ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸（Ａｓｐｏ）对 Ｋ５６２细胞生长特性的影响,探讨其在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）基因治疗中的意义。方法：倒置显微镜下细胞活体观察;Ａｓｐｏ与细胞共同培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及 １２０ｈ,用０．４％台盼蓝染色计各处理组死活细胞数,甲基纤维素半固体培养法观察其克隆形成率的变化,流式细胞仪测定各处理组细胞Ｐ２１０蛋白表达变化。结果：Ａｓｐｏ处理后细胞仍呈克隆状生长,当 Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ时,即可产生增殖抑制作用,呈一定的量效关系,其最大抑制效应时间为作用１２０ｈ,当Ａｓｐｏ达１０μｍｏｌ／Ｌ时,在一定细胞浓度范围内（１×１０４／ｍＬ－ ５× １０５／ｍＬ）,均有显著抑制作用,当Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ以上时,Ｋ５６２细胞 Ｐ２１０蛋白表达明显下降甚至不表达。 ｂ２ａ２型 Ａｓｐｏ对表达 ｂ３ａ２型 ｍＲＮＡ的 Ｋ５６２细胞也表现出交叉抑制作用。结论：ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞具有特异性增殖抑制作用,在慢性粒细胞白血病基因治疗中值得深人研究。     

hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Jurkat细胞凋亡的影响

目的:用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Jurkat细胞端粒酶活性后, 观察化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对Jurkat细胞凋亡的影响。方法:采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对Jurkat细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果: hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙, 对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide, SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比, 无显著差异(P>0.05) 。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂, 分别与SODN联合顺铂作用组、单用顺铂作用组相比, 对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂作用48 h, 细胞出现典型的凋亡形态学改变, 经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带, 而SODN与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到DNA梯形条带。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于Jurkat细胞48h的凋亡细胞百分率(25.18±3.63)%分别同SODN与顺铂联合作用组(10.07±2.12)%、单用顺铂作用组(9.73±2.43)%进行比较有显著差异(P<0.01)。 结论:hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Jurkat细胞凋亡。     

hTERT基因反义核酸提高原代复发急性淋巴细胞白血病细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的反义核酸（AS PS-ODN）能否增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。 方法:采用免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平，以台盼蓝拒染法计数细胞数，通过细胞形态学观察及流式细胞仪细胞周期的分析来检测凋亡。 结果:hTERT基因反义核酸能降低hTERT蛋白的表达。顺铂与hTERT基因反义核酸联合应用能明显抑制培养原代细胞的增殖，与单用顺铂组比较P<0.05。凋亡检测，用药48 h后，单用顺铂、顺铂联用反义核酸或正义核酸组，经Hoechst33258和PI双染法观察细胞均表现典型的细胞凋亡的形态学改变；顺铂联用反义核酸组，细胞的凋亡率明显高于单用顺铂组（P<0.05）。 结论:hTERT基因反义核酸能增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。     

反义治疗与白血病靶基因研究进展

反义技术是根据碱基互补原理 ,利用与目标靶ＤＮＡ或ＲＮＡ互补的短链片断封闭基因表达。反义技术用于抗白血病的理论基础 ,是用反义核酸中止原癌基因或癌基因的表达 ,使白血病细胞分化或凋亡 ,达到治疗的目的。其特点是 ,特异性强 ,对正常细胞无明显影响。反义核酸能在核酸水平上抗白血病 ,优于在蛋白水平的作用。基本内容包括 :反义ＲＮＡ、反义ＤＮＡ、核酶 (ｒｉｂｏｚｙｍｅ)和三股螺旋ＤＮＡ(ＤＮＡ -Ｔｒｉｐｌｅｘ)。主要通过下列作用之一或联合作用抑制靶基因表达 :1 与双链ＤＮＡ形成三链结构 ,使ＤＮＡ转录受阻。 2 结合靶ｍＲ…     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠胸腺淋巴细胞增殖

目的:观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠胸腺淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:Ficoll密度梯度离心法分离大鼠胸腺淋巴细胞。利用Iipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠胸腺淋巴细胞,-TdR掺入法及MTS法检测淋巴细胞增殖,RT-PCR检测c-mycmRNA的表达。结果:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖,但此抑制作用无浓度依赖性,反义c-myc寡核苷酸可降低胸腺淋巴细胞c-mycmRNA的表达。结论:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖。     

反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究

目的： 研究反义c-myc寡核苷酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法： 设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞，通过MTT法、流式细胞仪、HE染色及透射电镜方法，观察和分析其对人骨肉瘤MG-63细胞作用的效果。结果： MTT法示反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖，10.0 μmol/L、作用48 h效果最明显；流式细胞仪检测证实反义c-myc寡核苷酸（终浓度10.0 μmol/L）诱导瘤细胞的凋亡率达37.92%，出现明显的凋亡峰，并可抑制c-myc基因蛋白的表达；细胞呈典型凋亡特征。结论： 反义c-myc寡核苷酸能有效诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

抑制氯通道CLCN2基因表达对顺铂诱导胶质瘤U251细胞损伤的影响

目的： 探讨使用特异性CLCN2反义寡核苷酸抑制CLCN2基因表达对顺铂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤的影响。方法：U251细胞按处理方法不同分4组,对照组（转染无义寡核苷酸）、转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组（无义寡核苷酸与顺铂联用）、CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组。应用MTT法检测U251细胞生存率;RT-PCR检测CLCN2、cyclinD1 mRNA表达;TUNEL法检测细胞凋亡率。结果：与对照组相比,转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组和CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组U251细胞生存率、CLCN2 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加;与顺铂组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组细胞生存率（P＜0.05）、CLCN2、cyclinD1 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加（P＜0.01）;与CLCN2反义寡核苷酸组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组CLCN2 mRNA表达明显降低（P＜0.01）。结论：①转染CLCN2反义寡核苷酸能有效抑制CLCN2 mRNA表达;②抑制CLCN2 mRNA表达能促进顺铂对U251细胞的损伤作用;③CLCN2基因表达降低参与顺铂对U251细胞损伤作用。     

Survivin反义寡核苷酸抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的：研究survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌耐药细胞株移植裸鼠皮下后，移植瘤生长的抑制作用。方法:将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM裸鼠移植瘤模型，随机分为：空白对照组、单纯脂质体转染组、正义链转染组、200 μg/L ASODN组、400 μg/L ASODN组和600 μg/L ASODN组，观察裸鼠移植瘤体积，计算抑瘤率。免疫组化检测Survivin蛋白的表达。结果:A组、B组和C组移植瘤随时间增长而增大，但3组间无显著差异（P>0.05）。D组、E组和F组注射ASODN后，裸小鼠移植瘤的体积随着注射ASODN时间的延长和ASODN浓度的增加，移植瘤生长越来越小，并呈时间-剂量-效应依赖性。实险第20 d D组、E组和F组的肿瘤抑制明显大于A组、B组和C组（P<0.05）。HE染色见对照组移植瘤细胞密集成群，核大深染，而ASODN组见肿瘤细胞少，癌细胞皱缩变圆，胞核固缩深染。免疫组化见对照组肝癌细胞浆Survivin蛋白表达较强，而ASODN组Survivin蛋白表达较弱。结论:Survivin反义寡核苷酸能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

半乳糖受体介导的c-myc反义核酸对人肝癌细胞

目的 :探讨半乳糖 (Gal) -聚乙烯亚胺 (PEI) -c -myc反义寡核苷酸 (ASODN)交联复合物对人肝癌细胞增殖的影响。方法 :Gal-PEI-ASODN复合物作用于人肝癌Bel- 74 0 2细胞 ,台盼蓝染色法检测不同时间、不同浓度作用下细胞增殖的变化 ,倒置显微镜观察细胞形态 ,流式细胞仪分析细胞亚二倍体的百分率 ,透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果 :在 0 - 96h的不同时间点 ,与ASODN组 (含ASODN 2 0 μmol/L)相比 ,Gal-PEI-ASODN复合物 (含ASODN 0 75 μmol/L)明显抑制Bel- 74 0 2细胞的增殖 ,Gal-PEI -ASODN复合物的起效浓度更低 ,起效时间更短 ;不同浓度的单纯ASODN与Bel- 74 0 2细胞作用 72h ,测得ASODN的IC50 为 2 0 9μmol/L ,而在半乳糖受体的介导下 ,ASODN与Bel- 74 0 2细胞作用 4 8h ,测得ASODN的IC50 为 0 2 94 μmol/L ,ASODN的抑制效果提高 70 9倍 ;Gal-PEI -ASODN复合物与Bel- 74 0 2细胞作用 4 8h ,与单纯ASODN组相比 ,细胞亚二倍体百分率更高 ,并且电镜下可见明显的细胞凋亡形态。结论 :半乳糖受体介导的投递系统可明显提高ASODN对Bel- 74 0 2细胞的增殖抑制效应     

反义PKCα对CNE-2Z细胞周期的影响

目的:观察蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞生长、细胞周期和cyclinE表达的影响。方法:脂质体法转染反义PKCα,MTT法测细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及点印迹法检测cyclinE表达。结果:①随着反义PKCα的浓度增加,细胞生长指数逐渐降低(P＜0.01)。②反义PKCα使细胞G₁期百分比增高(P＜0.05)。③反义PKCα使细胞cyclinE的表达减弱,扫描定量反义PKCα组为对照组的66.5％±18.4％(P＜0.05)。结论:反义PKCα可通过抑制cyclinE表达、阻滞细胞于G₁期从而抑制CNE-2Z的生长。