检测人乳头瘤病毒DNA的技术方法─—原位PCR技术

人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）是一种嗜鳞状上皮的环状链DNA病毒,至今已经发现超过60种以上的亚型[1],而与人类上皮肿瘤发生关系最大的是HPV16．18型,随着致癌基因研究的深入,人们发现HPV16、HPV18型的E6、E7蛋白在致癌过程中起关键的作用,一般认为HPVE6蛋白能与P53肿瘤抑制基因结合形成复合物加速P53蛋白的降解过程,使其抑制肿瘤细胞的发生、发展的功能失效。同样,外肿瘤抑制基因产物与HPV18E7蛋白通过一个结构互补的部位形成一个复合物,使灿蛋白不能与特定的内源蛋白（EZF）结合,磷酸化过程受阻,导致细…     

HPV16,18E6和p53蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达

目的探讨HPV16，18E6和p53蛋白在人乳腺浸润性导管癌组织中的表达的意义。方法采用免疫组化技术检测60例乳腺浸润性导管癌、30例乳腺腺病和30例正常乳腺组织中HPV16，18E6蛋白和p53蛋白。结果乳腺浸润性导管癌组中HPV16，18E6蛋白阳性和HPV16，18E6蛋白阴性两组间p53蛋白的阳性表达差异均有显著性（P〈0．05），HPV16，18E6蛋白阳性组显示与p53蛋白表达呈显著负相关（r=-0．2954，P〈0．05）。结论高危HPV16、18型感染后导致野生型P^53的灭活和降解可能涉及HPV16、18型感染后人乳腺上皮细胞癌变的转化和发生过程。     

胃癌组织中HPV(16、18)E6,p5 3,p21WAF1基因蛋白表达的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16、18型[HPVC(16、18)]感染与p53,p21WAF1在胃癌发生机制中的作用.方法采用Envision System免疫组化技术检测50例胃癌、30例胃粘膜慢性炎组织中的HPV(16、18)E6,p53,p21WAF1蛋白并分析它们之间的关系.结果胃癌、胃粘膜慢性炎组中HPV(16、18)E6,p53,p21WAF1蛋白表达的阳性率分别为56.0%、58.0%、24.0%;6.67%、0.00%、63.33%.HPV(16、18)E6、p53及p21WAF1在胃癌与慢性炎组的阳性表达均有显著性差异(P＜0.01);胃癌组中HPV(16、18)E6与p53阳性表达呈正相关(P＜0.01,r=0.5613);p53与p21WAF1的表达有显著性差异(P＜0.01),呈负相关(r=-0.091 1).结论高危HPV(16、18)感染所致的p53失活、突变,p21WAF1缺失或低表达与本地区胃癌的病理发生机理密切相关.     

人乳头瘤病毒致癌机制的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)是一种常见的小DNA双链病毒,主要感染上皮黏膜细胞,引起良性乳头瘤病变和恶性肿瘤,高危型HPV在子宫颈癌组织中的检出率可高达90%以上。E6和E7是HPV最重要的两个病毒癌基因,在病毒整合入宿主细胞基因组后可持续表达,并分别与细胞内重要的抑癌基因p53和pRb的蛋白产物相互作用,阻遏其对细胞增殖分化的负调控,从而诱发细胞恶性转化。此外,E6和E7表达还可影响基因组稳定性。     

宫颈上皮内瘤变中不同高危型HPV感染与p53表达的相关性研究

目的 探讨宫颈上皮内瘤变(CIN)病例中不同高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染时p53的表达情况.方法 60例CIN病例(HC2检测高危型HPV为阳性,宫颈活检组织学证实为CIN)的石蜡标本,采用原位杂交方法检测HPV16/18、HPV31/33,并用免疫组织化学检测其p53蛋白的表达.以20例宫颈鳞状细胞癌为阳性对照,20例正常宫颈为阴性对照.结果 CIN病例中HPV16/18感染组、HPV31/33感染组及其他高危型HPV感染组(HPV35、39、45、51、52、56、58、59、68)p53阳性表达率分别为15.56％、13.75％、17.14％,三者之间差异无显著性(P＜0.05).结论 不同亚型高危型HPV感染的CIN病例,p53表达率相近,推测不同亚型高危型HPV对宿主p53影响可能相同,与宿主p53结合的量可能相同;CIN与不同高危型HPV的相关程度和p53的突变可能无明显相关性.     

MDM2和p53在宫颈鳞癌中的表达及与高危型HPV感染的关系

目的 探讨宫颈鳞癌组织中MDM2、p53的表达及与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系.方法 选取实验组30例宫颈鳞癌组织及对照组20例正常宫颈组织,石蜡包埋后,采用免疫组化法检测组织中MDM2、p53蛋白的表达;采用杂交捕获二代实验(HC2)的方法检测实验组及对照组宫颈分泌物中高危型HPV的表达.结果 MDM2、p53在宫颈鳞癌组织中的表达阳性率分别为90％、86.7％,高危型HPV(HR-HPV)在宫颈鳞癌患者宫颈分泌物中的检出率为83.3％;p53在HR-HPV阳性的宫颈鳞癌患者中阳性表达率为92％,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);经Spearman相关分析显示,P53与高危型HPV在宫颈鳞癌中的表达呈正相关(r =0.822,P＜0.05).结论 MDM2、p53与宫颈鳞癌的发生有关;高危型HPV感染可能是p53由抑癌基因转变为癌基因的关键因素.     

人乳头瘤病毒致癌特性及其E6和E7蛋白致癌机制的研究进展

人乳头瘤病毒（HPV）是一种感染人的乳头瘤病毒科病毒,主要感染上皮细胞,其高危型别（主要是16和18型）可引起恶性肿瘤。高危型HPV感染上皮细胞后,其DNA能整合入细胞基因组,并由于其E2基因表达障碍不能有效抑制E6、E7基因转录而持续高表达E6和E7 2种癌蛋白。E6和E7蛋白可分别抑制P53蛋白和pRb蛋白的作用而使细胞周期失控,在细胞基因组受到损伤时细胞周期仍然向前进展;E6蛋白能通过影响多种凋亡调节蛋白或因子的表达而抑制细胞凋亡;E6蛋白和E7蛋白能协同作用上调端粒酶的表达而使细胞永生化;以上机制最终导致受感染细胞发生恶性转化或癌变。本文对HPV的致癌特性及其所表达的E6蛋白和E7蛋白扰乱细胞周期、抑制细胞凋亡并活化端粒酶使细胞永生化的致癌机制的研究进展进行了综述。     

人乳头瘤病毒16型E2/E6癌基因与宫颈癌关系的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2/E6癌基因在宫颈癌发生中的作用。方法采用以医院为基础的1∶1配比病例对照研究,应用热启动PCR法检测经病理诊断确诊的74例宫颈鳞癌新发病例,及同期就诊的74例宫颈良性肿瘤患者的高危型HPV16 E2/E6癌基因的状况。结果病例组HPV16 E2、E6阳性率(41.89%,52.70%)高于对照组(17.57%,21.62%),差别有统计学意义,OR分别为3.250(1.471-7.178)和3.875(1.824-8.233);病例组HPV16 E2缺失率较对照组略高。结论宫颈癌的发生与HPV感染,特别是高危型HPV16的感染密切相关;HPV16 E2基因缺失、E6基因高阳性率在宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

HPV16 E6基因变异通过调控BDNF/TrKB表达促进宫颈癌细胞增殖的研究

目的:明确人乳头瘤病毒E6(HPV16 E6)基因变异对宫颈癌细胞增殖影响的机制研究.方法:采用Real-time PCR检测宫颈癌组织及宫颈上皮内瘤样病变Ⅱ级(CINⅡ)宫颈组织样本中HPV16 E6 T350G、脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体B(TrKB)及肿瘤蛋白53(p53)mRNA的表达水平;...     

宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型方法的建立

【立论依据】 高危型HPV在感染过程中产生的病毒源性癌蛋白E6、E7在宿主细胞中呈过度表达,是致宫颈癌的关键因素。已经证实,病毒基因组整合到宿主染色体是HPV致癌的重要因素。HPV DNA的整合不但改变整合位点及临近宿主基因的表达,而且可使HPV衣壳蛋白基因(L1和L2)片段缺失,这严重限制了目前临床上使用的基于L1基因序列的HPV检测及分型。本研究拟选择宫颈癌组织高表达的E6、E7基因序列,设计特异性探针及引物,优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,可快速对宫颈癌组织中高危型HPV进行检测和分型。 【设计思路】 设计HPV不同型别E6/E7特异性探针及引物,优化PCR条件,扩增宫颈肿瘤组织标本中高危型HPV E6/E7基因,结合测序,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,对宫颈癌组织高危型HPV进行检测和分型,并与目前临床上广泛使用的检测方法比较,验证该方法的敏感性和特异性。 【实验内容】 收集低度上皮内瘤变(LSIL)、高度上皮内瘤变(HSIL)和宫颈癌组织样本等不同类型的宫颈肿瘤组织标本,抽提DNA;根据高危型HPV早期基因 E6/E7基因序列,在同源性分析的基础上,设计HPV不同型别的E6/E7特异性探针及引物, PCR扩增宫颈肿瘤组织标本DNA,通过基因测序验证PCR扩增的特异性;进一步优化PCR条件,建立高危型HPV检测到的多重PCR技术,检测宫颈肿瘤组织标本中HPV感染及型别,并与目前临床上使用的检测试剂盒比较,分析检测的灵敏性和特异性。 【材料】 LSIL组织样本、HSIL组织样本和宫颈癌组织样本各30例; HPV16+Siha细胞、HPV18+Hela细胞;不同型别HPV的E6/E7特异性探针及引物;高保真PCR酶及反应体系;琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳检测系统等。 【可行性】 本项目立论依据充分,标本来源丰富,前期预实验已运用此方法对高危型HPV16/18完成初步分型。 【创新性】 迄今尚无相关研究报道。本检测方法的建立为我国高危型HPV流行检测及宫颈癌疫苗的推广奠定基础。     

p53基因第72位密码子多态性与宫颈癌及HPV-16、18 E6之间关系的研究

目的探讨宫颈癌及其癌前病变中p53基因第72位密码子多态性的表达及其与HPV16、18E6表达之间的关系,以了解p58基因第72位密码子多态性是否可以作为预测宫颈癌发生的一项高危因子。方法以PCR法检测81例宫颈鳞癌（高分化13例、中分化24例、低分化44例;Ⅰb期24例、Ⅱa期15例、Ⅱb期37例、Ⅲa期5例）、18例宫颈腺癌、88例宫颈上皮内瘤样病变（CINⅡ30例、CINⅢ58例）及60例正常宫颈组织中p53基因第72位密码子多态性及HPV16、18E6的表达。结果p53Arg纯合子、p53Arg／Pro杂合子及p53Pro纯合子在宫颈鳞癌、腺癌和CIN（Ⅱ～Ⅲ）中分别占58．02％、30．86％、11．12％;55．55％、27．78％、16．67％I59．09％、21．59％、19．32％。各组中p53Arg纯合子明显高于p53Arg／Pro杂合子及p53Pro纯合子,且差异有统计学意义（P〈0．05IP〈0．01）。正常宫颈组织中p53Arg纯合子、p53Arg／Pro杂合子及p53Pro纯合子分别为23．33％、40．OO％、36．67％,三者间无统计学意义（P〉0．05）。宫颈癌组（鳞癌及腺癌）、CIN（Ⅰ～Ⅱ）组中p53Arg纯合子均高于正常对照组中p53Arg纯合子,且差异有统计学意义（P〈0．05）;宫颈鳞癌中HPVl6、18E6（＋）亚组中p53Arg纯合子显著高于HPV16、18E6（-）亚组及HPVl6、18E6（＋）正常对照组亚组（P〈0．05,P〈0．01）。各组中p53Arg纯合子均高于p53Pro纯合子（P〈0．05）;p53Arg纯合子及等位基因均未随宫颈癌临床分期及分化程度而变化,与宫颈癌前病变程度亦无关系。结论p53Arg纯合子可作为预测宫颈癌及其癌前病变的一项高危因子,与高危型HPVE6同时检测可提示宫颈病变的发展趋势;p53Arg纯合子与宫颈癌临床分期及分化程度无明显相关性。     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

大肠癌组织中HPV16、18E6,ras癌基因蛋白表达的研究

为探讨人乳头瘤病毒 16、18型感染与 p2 1ras癌基因协同在大肠癌发生机理中的作用 ,采用SP免疫组化技术 ,检测30例大肠腺瘤、10例腺瘤恶变、5 3例大肠腺癌和 30例正常大肠粘膜组织中HPV16、18E6 ,p2 1ras蛋白并分析其相互关系。结果显示 :腺瘤、腺瘤恶变和腺癌组中E6 ,p2 1ras的阳性表达分别为 36 .7% (11/ 30 )、40 .0 % (12 / 30 ) ,6 0 .0 % (6 / 10 )、70 .0 % (7/ 10 )和 5 4.7% (2 9/ 5 3)、71.7% (38/ 5 3) ,而正常组均呈阴性表达。在腺瘤组中 ,随着上皮不典型性增生程度的加重 ,E6、p2 1ras的阳性表达呈逐渐上升的趋势。腺瘤伴不典型性增生Ⅱ～Ⅲ级组中E6、p2 1ras阳性表达显著高于腺瘤伴不典型性增生Ⅰ级 (P <0 .0 5 )。此外 ,腺瘤、腺瘤恶变及腺癌组中E6与 p2 1ras的双阳性表达差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。在有淋巴结转移组中 ,E6的阳性表达和E6与p2 1ras的双阳性表达均显著高于无淋巴结转移组 (P <0 .0 5 )。提示高危HPV16、18感染并在活化的ras癌基因的协同参与下 ,与本地区大肠癌的发生、发展过程密切相关 ,在腺瘤中同时检测E6、p2 1ras蛋白有可能成为大肠癌早期诊断的免疫学指标之一。     

HPVE6、E7与p53蛋白表达在非小细胞肺癌中的相关性研究

目的探讨人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）E6、E7和p53蛋白在非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）中的表达及相关性。方法应用免疫组化方法（IHC）分别检测60例NSCLC组织中HPVE6、研原癌蛋白和p53蛋白的表达情况。结果NSCLC中HPVE6、E7原癌蛋白的检出率为41．7％；p53的阳性率为61．7％；HPVE6、E7阳性表达与高中分化程度的NSCLC及吸烟相关，且HPVE6、E7阳性表达组中p53蛋白阳性表达率（70．3％）显著高于阴性组（48．6％）（P〈0．05）。结论HPV感染可能导致p53基因突变，可能是NSCLC发生的另一重要病因学因素。     

维吾尔族妇女子宫颈癌中 p53 基因的表达和 HPV DNA 检测研究

应用Ｅ６特异性引物ＰＣＲ检测新疆维吾尔族妇女子宫颈癌活检组织标本中的ＨＰＶ６，１６和１８ＤＮＡ。并应用免疫组化研究ｐ５３基因的表达。结果显示，６５例标本中７例不适应用于ＰＣＲ，其余５８例中ＨＰＶ１６ＤＮＡ阳性４５例（７７．６％），而ＨＰＶ６ＤＮＡ和１８ＤＮＡ为阴性。免疫组化显示，６５例中ｐ５３表达阳性４９例（７５．４％）。在４５例ＨＰＶＤＮＡ阳性标本中，ｐ５３表达阳性３４例（７５．６％）；１３例ＨＰＶＤＮＡ阴性标本中，ｐ５３表达阳性１１例（８４．６％）。提示，ＨＰＶ阳性或阴性与ｐ５３表达之间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。     

中药对肾病综合征激素疗法副作用的疗效观察

目的 观察中药对肾病综合征时间、大剂量使用激素而产生诸多副作用的疗效。方法 将肾病综合征激素治疗病人随机分为两组,一组22例同时服用中药,并根据辩证施治选择不同方剂,治疗其副作用。另一组20例未用中药作为对照组。对两组的疗效进行对比观察。结果 治疗组对激素疗程的副作用治愈率、总有效率分别为68．8％、81．8％,显著高归于对照组的30％、35％（P＜0．05）。结论 对肾病综合征正规激素疗程中易产生各种副作用,各药辩证施治,能有效地治疗其副作用。     

肺鳞癌与人乳头瘤病毒及p53表达的关系

目的 探讨肺鳞癌组织中人乳头瘤病毒（HPV）感染与p53蛋白表达的关系并分析作用机制。方法 收集84例肺鳞癌和18例支气管粘膜慢性炎症标本，采用地高辛标记的HPV－DNA探针，用原位杂交法检测组织中的HPV－DNA存在情况，并用免疫组化SABC法检测肺鳞癌组织中p53及HPVE6,E7蛋白的表达，将二者进行对照观察。结果 ①HPV原位杂交阳性信号位于细胞核内，肺鳞癌HPV检出率为49％，对照组慢性炎为6％，差异显著。②肺鳞癌组织中存在HPVE6，E7蛋白表达，免疫组化方法与原位杂交方法结果相符。③84例肺鳞癌中30例检出p53蛋白表达，其中17例HPV阳性，13例HPV阴性，HPV阳性组与阴性组差异不显著。结论 肺鳞癌与HPV感染关系密切，肺鳞癌组织中也存在p53基因表达，p53蛋白积聚与HPV感染无明显相关性。     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及其调控因子的影响

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６／Ｅ７基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子ｐ５３,ｐＲｂ的影响。方法 Ｌｏｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ介导法进行 染,筛选阳性克隆,免疫荧光染色检测ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染细胞内的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化,免疫印迹分析ｐ５３,ｐＲｂ表达情况。结果 免疫荧光染色检测见转染细胞内有ＨＰＶＥ６／Ｅ７表达,汉式细胞仪显示转染细胞Ｇ１期细胞为４９．２％比正常     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞 凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki 4组细胞24和48 h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加(P＜0.05)。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达(P＜0.01),而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P 3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变(P＞0.05)。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24 h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48 h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞(P＜0.05),且两组细胞48 h的HPV16E6 mRNA表达均较24 h显著增高(P＜0.05);在24和48 h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少(P＜0.01);但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型(p53mt/p53wt )无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。