小鼠骨髓基质细胞成内皮细胞分化及其缺血区存活能力研究

目的 探讨体外培养的骨髓基质细胞的部分生物学特性、成内皮细胞分化能力及在缺血区存活能力？方法 2005年1月至11月，第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心分离5～6周龄的小鼠胫骨、股骨，预冷的DMEM／F12培养基冲洗出骨髓，密度梯度离心分离出骨髓单核细胞，接种后12～16d形成单层贴壁的成纤维样细胞：体外诱导分化鉴定分离的细胞：建立下肢缺血模型，荧光标记的体外扩增的骨髓基质细胞被移植入缺血组织，移植后1周，荧光显微镜及HE染色，检查荧光强弱分布与HE染色密度的时空关系。结果 体外传代培养的基质细胞诱导后分泌NO，移植1周在缺血区检测到大量荧光阳性细胞存活。结论在本实验条件下，体外培养的骨髓基质细胞生长稳定，传代后的细胞增殖较快，表现出较早期细胞特点，在体外能分化为血管内皮细胞，可望用作缺血性心脏病的细胞治疗的供体细胞。     

小鼠骨髓基质细胞成内皮细胞分化及其缺血区存活能力研究

目的探讨体外培养的骨髓基质细胞的部分生物学特性、成内皮细胞分化能力及在缺血区存活能力。方法2005年1月至11月,第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心分离5~6周龄的小鼠胫骨、股骨,预冷的DMEM/F12培养基冲洗出骨髓,密度梯度离心分离出骨髓单核细胞,接种后12~16d形成单层贴壁的成纤维样细胞。体外诱导分化鉴定分离的细胞。建立下肢缺血模型,荧光标记的体外扩增的骨髓基质细胞被移植入缺血组织,移植后1周,荧光显微镜及HE染色,检查荧光强弱分布与HE染色密度的时空关系。结果体外传代培养的基质细胞诱导后分泌NO,移植1周在缺血区检测到大量荧光阳性细胞存活。结论在本实验条件下,体外培养的骨髓基质细胞生长稳定,传代后的细胞增殖较快,表现出较早期细胞特点,在体外能分化为血管内皮细胞,可望用作缺血性心脏病的细胞治疗的供体细胞。     

小鼠骨髓基质细胞参与缺血组织血管再生及时相关系

目的探讨体外培养的骨髓基质细胞体内移植后在缺血区新血管生成中的作用及其时相关系.方法分离5～6周龄的小鼠胫骨、股骨,用预冷的DMEM/F12培养基冲洗出骨髓,经密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞体外培养.体外成内皮细胞诱导分化鉴定分离的细胞,建立下肢缺血模型,荧光标记的体外扩增的骨髓基质细胞移植入左侧缺血组织,右侧注射等量培养介质作为对照组,分为7d、14d、28d 3个观察期(n=6),冰冻切片荧光显微镜观察,毗邻切片HE及vWF染色,检查荧光阳性细胞与染色阳性细胞的时空关系,并计算移植前后毛细血管密度的变化.结果体外分离培养的骨髓基质细胞在成内皮细胞供及物存在条件下表达vWF,并分泌NO.移植后7d,观察到大量分散开来的DAPI标记细胞存活(蓝色荧光),毗邻切片HE染色显示了高密度HE染色阳性区和荧光阳性区的一致性,MSC来源的供体细胞核浆比大,提示是较幼稚细胞,移植区未见明显炎症反应.移植后14d,组织切片可见大量荧光标记细胞存活,呈与骨骼肌直径大小相似的网状散在分布,对照组未见荧光,在毗邻的切片,大部分荧光阳性细胞vwF因子染色阳性,毗邻切片的HE染色,细胞移植组骨骼肌纤维未见明显异常,而对照组骨骼肌可见部分肌纤维变性.移植的28d,移植组毛细胞血管数量为(57±18)mm2,对照组为(36±12)mm2,移植组高于对照组(P＜0.05).结论体外培养的骨髓基质细胞在体外能够定向分化为血管内皮细胞,移植入体内缺血区能促进缺血区新血管生成,可望用作组织缺血细胞治疗的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 获取成年大鼠胫骨干骨髓，采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代，观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果 大鼠骨髓基质细胞贴壁旱集落生长，5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

大鼠骨髓基质细胞培养方法的改良

目的　对体外分离培养大鼠骨髓基质细胞 (BMSC)方法进行改良 ,观察其生物学特点。方法　分离大鼠胫骨、股骨 ,以 IMDM培养基冲洗骨髓 ,与培养液混合后直接接种至培养瓶中 ,接种后 7～ 14 d形成单层贴壁的成纤维状细胞。检测传代细胞接种贴壁率、生长曲线、细胞周期 ,电镜观察细胞超微结构。结果　分离培养的原代 BMSC生长良好 ,倍增时间约为 4 2 h。 BMSC传代后 12 h贴壁率达 80 %以上 ,82 %的细胞处于 G0 、G1 期 ,超微结构呈现较早期细胞特点。结论　改良法培养的 BMSC生长稳定 ,传代细胞适应性强。与传统培养方法比 ,该法操作简单、实用性强 ,可以用于 BMSC的体外实验研究     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法获取成年大鼠胫骨干骨髓,采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代,观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长,5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。结论骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

骨髓基质细胞在缺血心肌内存活及血管新生作用

目的观察体外扩增骨髓基质细胞(MSCs)在缺血心肌内存活以及其诱导血管新生作用. 方法无菌条件下从兔股骨和胫骨抽取抗凝骨髓,采用密度梯度离心获取单个核细胞,接种于DMEM/F-12培养基差速贴壁粘附纯化MSCs,建立体外培养体系,体外扩增传代,收获第二代细胞行4,6二氨基-2-苯茚二酮(DAPI)标记.     

基质细胞衍生因子1对骨髓单个核细胞向肝脏迁移分化的影响

目的 探索基质细胞衍生因子1对骨髓单个核细胞向肝脏迁移、分化的影响。方法建立小鼠CCl4-AAF肝损伤模型，从小鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞，以荧光染料PKH26标记后经尾静脉输入肝损伤模型的小鼠体内，实验组立即给予肝内注射基质细胞衍生因子1，对照组给予肝内注射盐水，12d后取肝组织，在荧光显微镜下观察两组骨髓单个核细胞向肝脏迁移的差异，并用免疫组化法测定移植细胞的白蛋白表达。结果 PKH26标记阳性的细胞20倍镜下实验组中每张切片平均迁移数为（195．40±9．095）个，对照组平均迁移数为（169．80±7.983）个（P〈0．05）。免疫组化显示移植细胞可以表达白蛋白。结论 基质细胞衍生因子1可以促进骨髓单个核细胞向肝脏迁移，并且迁移至肝脏的骨髓单个核细胞可以向肝细胞分化。     

大鼠骨髓单个核细胞体外诱导向内皮分化的研究

目的 :为组织工程研究作准备 ,分离大鼠骨髓单个核细胞并诱导培养向内皮分化。方法 :成年SD大鼠 ,应用Ficoll淋巴细胞分离液 (密度1 .0 77g/ml) ,将长骨骨髓经非连续密度梯度离心 ,收集中层的单个核细胞 ,加入诱导培养基并置于纤维连接素包被的培养板上进行诱导分化 ,观察细胞生长状况 ,以透射电镜及Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化以及流式细胞仪方法对培养细胞进行鉴定。结果 :细胞圆形、纺锤形单层融合贴壁生长 ;Ⅷ因子、CD3 1、Lectin免疫组化染色阳性 ;透射电镜显示细胞具有内皮特征性的Weibel Palade小体。结论 :采用Ficoll密度梯度离心可获得较高纯度的骨髓单个核细胞 ,经体外培养并诱导分化 ,具有血管内皮细胞的特征     

小鼠骨髓基质细胞成内皮细胞分化及缺血区存活能力

目的探讨体外培养的骨髓基质细胞的部分生物学特性、成内皮细胞分化能力及在缺血区存活能力. 方法分离5～6周龄的小鼠胫骨、股骨,预冷的DMEM/F12培养基冲洗出骨髓,密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞,接种于DMEM/F12培养基中(含10%优质胎牛血清及双抗).     

不同年龄段大鼠血清影响内皮祖细胞向成熟内皮诱导分化

目的观察不同年龄段大鼠血清对骨髓内皮祖细胞向成熟内皮细胞诱导分化的影响。方法无菌取1~2月龄、19~26月龄Sprague-Dawley大鼠股骨和胫骨,获取骨髓单个核细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,经差速贴壁法对二次贴壁细胞在纤维连接蛋白包被的培养板或培养瓶进行体外培养,以DiI-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色和FITC-CD31染色进行鉴定;收集制备相应年龄段(1~2月龄、19~26月龄)大鼠血清,将内皮祖细胞分为老年大鼠内皮祖细胞 老年大鼠血清组、老年大鼠内皮祖细胞 年轻大鼠血清组、年轻大鼠内皮祖细胞 老年大鼠血清组、年轻大鼠内皮祖细胞 年轻大鼠血清组。体外培养的内皮祖细胞经含20%不同年龄段大鼠血清的内皮条件培养基诱导培养后,激光共聚焦显微镜检测DiI-acLDLF、ITC-UEA-1双染色阳性率,免疫组织化学检测假血友病因子表达、逆转录聚合酶链反应分别检测内皮一氧化氮合酶、血管内皮生长因子受体2表达,体外血管生成实验观察内皮祖细胞参与管形生成能力。结果年轻大鼠血清显著提高老年大鼠内皮祖细胞在内皮条件培养基诱导培养后的DiI-acLDLF、ITC-UEA-1双染色阳性率(P<0.05),而老年大鼠血清显著降低年轻大鼠内皮祖细胞双染阳性率(P<0.05);年轻大鼠血清明显促进老年大鼠内皮祖细胞在内皮条件培养基诱导培养后的血管性血友病因子、内皮型一氧化氮合酶(P<0.01)及血管内皮生长因子受体2表达(P<0.05);年轻大鼠血清显著减少内皮条件培养基诱导培养后未参与血管生成的老年大鼠内皮祖细胞数(P<0.05)。结论年轻大鼠血清可显著增强老年大鼠内皮祖细胞向内皮细胞诱导分化的能力,而老年大鼠血清可部分抑制年轻大鼠内皮祖细胞向成熟内皮细胞诱导分化;年轻大鼠血清中可能存在激发衰老个体内皮祖细胞活力的系统性血清因子,这些因子可增强衰老个体来源的内皮祖细胞内在分化潜能。     

成人骨髓间充质干细胞的纯化及部分生物学特性的研究

目的探讨成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells或bone maglow stroma cells，MSCs)体外纯化的方法，观察其生物学特性，为其在风湿病治疗中应用提供了初步实验体系和依据。方法抽取健康正常人骨髓3-5ml，Percoll分离液分离后低糖达氏修正依氏培养基(LG—DMEM)培养，流式细胞仪检测表面标记物与细胞周期，绘制生长曲线，并对长时间培养的传代细胞行碱性磷酸酶(AKP)染色及Von Kossa染色。结果①经分离出的细胞为MSCs；②经自然纯化。第2代细胞(P2)与第3代细胞(P3)均质性分别达90％及98％以上；③纯化后，细胞在第3代(P3)细胞增生旺盛，第7代(P7)后细胞呈增长缓慢趋势；④MSCs长期培养，有向成骨细胞分化的趋势。结论利用MSCs特性，经自然纯化．是当前纯化MSCs的一种较好且行之有效的方法。     

NT-3基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及向神经元分化的影响

目的研究神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元分化的影响,探讨转染NT-3基因的MSCs体内移植治疗脊髓损伤的可行性。方法体外培养稳定表达NT-3蛋白的MSCs,通过MTT法检测NT-3对MSCs增殖的影响;应用免疫细胞化学和免疫印迹方法检测转染NT-3的MSCs表达神经元标志物NeuN蛋白的情况。结果转染NT-3基因的MSCs生长曲线上移,细胞增殖率显著升高,与对照组相比,两者有显著差异(P<0.05),表明转染NT-3后细胞生长加快。免疫荧光染色结果显示转染NT-3的MSCs的NeuN阳性细胞数明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05);Western印迹检测结果显示转染NT-3的MSCs内NeuN蛋白表达明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05),表明NT-3促进MSCs向神经元方向分化。结论 NT-3基因转染可促进MSCs的增殖,并诱导其向神经元方向分化。     

自体骨髓间叶干细胞诱导分化移植治疗房室阻滞的初步观察

利用诱导分化的骨髓间叶干细胞自体移植治疗房室阻滞,探讨生物介入方法治疗缓慢型心律失常的新途径。11只实验犬随机分为实验组(n=6)和对照组 (n=5)。应用射频技术消融His束,制备永久Ⅲ度房室阻滞动物模型;每只犬抽取 10ml犬骨髓液,应用密度梯度离心法及贴壁培养法分离、培养和扩增骨髓间叶干细胞, 5 氮胞苷对骨髓间叶干细胞进行诱导分化;房室阻滞 4周后,开胸心脏直视下将BrdU标记的分化干细胞 (1ml, 1. 5×107细胞)多点注射至该犬消融的His束部位,而对照组仅将 1mlDMEM培养液替代干细胞悬液多点注射至相同部位。术后 1~12周,应用心电图观察两组活体动物房室功能恢复情况,应用组织病理、免疫组化等技术对移植干细胞的存活、增殖、分化与缝隙连接功能进行评价。结果:在动物房室阻滞模型中,实验组犬在自体骨髓干细胞移植后 12周, 2 /6只犬的房室传导功能得以改善;病理与免疫组化示诱导分化的骨髓干细胞在His束区存活、增殖和分化为心肌细胞、血管内皮细胞,并与宿主细胞建立缝隙连接;而对照组 5只犬未见上述变化。结论:自体移植诱导分化的骨髓间叶干细胞有可能改善His束传导功能。     

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的：研究5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导体外骨髓间充质干细胞（marrow measenchymal stem cells，MSCs）向心肌细胞发展的作用及其机制。方法：从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs，培养传代后用不同浓度的5-aza诱导，倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期改变；MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响；免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达；RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果：5-aza对MSCs有抑制增殖的作用（P〈0．05）；在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化；免疫细胞化学检测结果表明，MSCs的经5-aza诱导14d，肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高（P〈0．01）；PT—PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显，而对照组未见表达。结论：MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞，这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。     

结肠炎大鼠炎症黏膜提取液对骨髓间质干细胞增殖和表面分化抗原的影响

背景:动物实验和临床试验均表明间质干细胞(MSCs)对受损肠道组织有一定修复作用,然而目前尚不清楚肠道炎症微环境对MSCs移植治疗炎症性肠病(IBD)有何影响。目的:通过体外实验观察结肠炎大鼠模型肠道炎症黏膜提取液对骨髓MSCs增殖和表面分化抗原的影响。方法:以全骨髓贴壁法分离和原代培养大鼠MSCs并行传代扩增。取三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎大鼠模型肠道炎症黏膜提取液(0、1、2、3 ml)与MSCs共培养,倒置相差显微镜观察各组细胞贴壁和生长情况,绝对计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面分化抗原表达。结果:全骨髓贴壁法可成功分离MSCs,所获细胞CD29、CD44表达阳性,CD105表达低度阳性,CD34、CD45表达阴性。3 ml炎症黏膜提取液处理组MSCs接种6 h后见细胞贴壁,36 h开始克隆性增生,此后细胞增殖速度较空白对照组明显加快,第6 d即达100%融合,但表面分化抗原表达与空白对照组相比无明显变化。结论:结肠炎大鼠炎症黏膜提取液可促进骨髓MSCs增殖,但对细胞表面分化抗原无明显影响。     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

人骨髓多能成体祖细胞的分离培养及向肝细胞样细胞分化的研究

目的 培养人骨髓多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPCs)并研究其向肝细胞样细胞的分化。方法 应用体外细胞培养技术将人骨髓中的单个核细胞从无血液疾病患者的髂嵴骨髓中分离出来后，用磁式细胞分离仪分离富集骨髓单个核细胞中的CD45^-HIA—DR^-细胞，把其接种于DMEM培养基中进行培养，到达对数生长期时，加入成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor-4，FGF—4)并改用维持液来诱导其向肝细胞样细胞分化，最后用免疫细胞化学方法检测其分化情况。结果 成功地进行了人骨髓MAPCs的原代和传代培养，并在体外成功地把其诱导分化为具有肝细胞表型特征的细胞。结论 FGF-4可诱导人MAPCs向具有肝细胞表型特征的细胞发生分化。