铜绿假单胞菌耐药性及氟喹诺酮类耐药相关基因的研究

目的 了解医院临床分离的铜绿假单胞菌耐药情况及氟喹诺酮类相关耐药基因存在状况.方法 用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验,用聚合酶链反应（PCR）检测parC、gyrA两种氟喹诺酮类耐药相关基因.结果 70株铜绿假单胞菌呈现多重耐药,对环丙沙星、左旋氧氟沙星的耐药率分别为51.4%、50.0%,其余11种的耐药率在10.0%～100.0%.在70株铜绿假单胞菌中,39（55.7%）株分离菌检出parC基因,18（25.7%）株分离菌检出gyrA基因.结论 临床分离的铜绿假单胞菌多重耐药严重,携带parC和gyrA基因是本组试验菌株对氟喹诺酮类抗生素耐药的重要机制.     

铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类耐药关系研究

目的：了解铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药的关系。研究其临床意义。方法：通过PCR HinfⅠ酶切分析,PCR－单链构象多态性分析（SSCP）等方法检测铜绿假单胞菌ATCC27853及36株铜绿假单胞菌临床分离株的gyrA基因突变情况。结果HinfⅠ酶切结果显示,所有13株环丙沙星耐药株,3株环丙沙星中介株中的2株,20株环丙沙星敏感株中的1株存在gyrA基因HinfⅠ酶切酶点突;SSCP分析结果显示,所有耐药菌株和中介菌株的gyrA基因基因HinfⅠ酶切位点突变密切相关,但gyrA基因突变不局限于该位点,在常规药敏试验的基础上开展gyrA基因突变检测有重要的临床意义。     

淋病奈瑟球菌耐氟喹诺酮类药物与gyrA和parC基因突变的相关性研究

目的研究淋病奈瑟球菌耐氟喹诺酮类药物与gyrA和parC基因突变的相关性。方法采用E试验测定30株临床分离的淋病奈瑟球菌对环丙沙星的MIC。PCR法检测30株淋病奈瑟球菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关gyrA和parC基因并测序分析。结果淋病奈瑟球菌对环丙沙星的耐药率达到100％，所有耐氟喹诺酮菌均存在gyrA基因双位点突变，20株高水平耐氟喹诺酮菌（MIC≥mg／L）均存在gyrA基因双位点突变和parC单（或双）位点突变。结论gyrA和parC基因突变在淋病奈瑟菌对氟喹诺酮类药物耐药中起着重要作用，gyrA和parC基因同时突变会导致耐药性增强。     

铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制的研究

目的研究30株铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法用PCR及测序法研究拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ的gyrA、gyrB、parC和parE基因;同时用琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星的MIC和加入羰基氢氯苯腙(CCCP)后的MIC,以确定存在外排机制。结果菌株中23株(76.7%)有gyrA突变,主要为Thr-83→Ile,第87位突变3株;10株(33.3%)parC基因突变,其中5株为Ser-87→Leu,3株第91位突变;gyrB和parE突变较少见。CCCP能显著降低环丙沙星和左氧氟沙星的MIC。结论铜绿假单胞菌的耐药性日趋严重,两类拓扑异构酶基因突变和外排泵机制是铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制。     

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位（gyrA）和拓扑异构酶Ⅳ C亚单位（parC）基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应（PCR）检测志贺菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序，分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示，9株耐萘啶酸菌均在gyrA83位发生有意义突变TCG（Ser）→TTG（Leu），宋内志贺菌未发生parC基因突变，5株耐萘啶酸、诺氟沙星和／或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC80位发生有意义突变AGC（Ser）→ATc（Ile）。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重，福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物，靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一，gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生，parC突变可能引起诺氟沙星和／或环丙沙星不敏感。     

运用PCR-RFLP技术研究耐喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA基因的突变

目的 研究临床分离的耐喹诺酮类铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.PA)gyrA基因突变情况.方法 以铜绿假单胞菌gyrA基因序列为靶序列,用PCR-RFLP、DNA测序等方法,对铜绿假单胞菌gyrA基因突变进行研究.结果 在57株耐喹诺酮类铜绿假单胞菌中,有35株(61.4%)菌gyrA基因的83位出现突变,其突变方式为Thr83(ACC)→Ile(ATC),其余22株(38.6%)耐喹诺酮类铜绿假单胞菌未发现基因位点突变.33株喹诺酮类敏感临床分离铜绿假单胞菌菌株未发现上述突变.gyrA基因的PCR扩增产物Sac Ⅱ酶切片段与它们测序结果一致.结论 gyrA基因83位氨基酸密码子突变(Thr-83→Ile)是临床分离铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制之一.     

耐喹诺酮铜绿假单胞菌药物作用靶位改变的研究

目的：探讨铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法30株对环丙沙星耐药的铜绿假单胞菌,采用 PCR方法扩增DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因 gyrA,gyrB,parC和 parE,再测序查找是否存在位点突变,同时用脉冲场电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）对菌株进行同源性分析。结果30株菌中,28株菌出现 gyrA基因扩增片段的137位点均有C→T突变,导致T83I改变;17株菌gyrB基因扩增片段的351位出现G→C突变,导致G466A改变;21株菌的 parC基因扩增片段的277位点有 C→U 突变导致 S87L 改变;2株菌 parE 基因在不同位点出现 C→U 突变,导致A425V和 A473V改变。30株菌可分为6个克隆,其中 A克隆4株,仅有 gyrA突变;B克隆7株,有 gyrA和 parC两种基因发生突变;C克隆3株,有gyrA和gyrB两种基因发生突变;D克隆14株,同时有 gyrA,gyrB和 parC三种基因发生突变;其他克隆2株,仅在 parE位点发生突变。结论该组菌株的靶位突变型与流行克隆型密切相关,同一流行型的菌株药物作用靶位的改变相同,并与环丙沙星的 MICs值的高低呈正比,突变基因数越多,MICs 值越高。4种基因中 gyrA基因突变频率最高,且该突变比其他靶位的突变对药物与靶位结合的影响更大,是需要关注的重点。     

gyrA、gyrB和外排系统共同介导铜绿假单胞菌对喹诺酮类耐药机制研究

目的探讨临床分离的对环丙沙星和左氧氟沙星均耐药的铜绿假单胞菌耐药机制。方法收集临床分离经VITEK-2（C0mpact细菌鉴定仪检测环丙沙星和左氧氟沙星均耐药的铜绿假单胞菌,琼脂稀释法测定环丙沙星和左氧氟沙星的MIC值,PCR扩增DNA促旋酶基因gyrA和gyrB以及DNA拓扑异构酶Ⅳ的parC和parE基因,实时-RT-PCR分析细菌外排系统表达情况。结果琼脂稀释法检测结果与VITEK-2 Compact细菌鉴定仪检测结果相符。PCR扩增测序发现以DNA促旋酶基因gyrA（在位点941处插入碱基C）和gyrB（3株在位点1588处缺失碱基A,其他菌株在位点1543处插入碱基T）基因缺失或者插入导致移码突变为主,parE基因有3株在位点1895处插入碱基C。实时定量PCR检测发现以mexA和mexC表达增加为主。结论检出的耐环丙沙星和左氧氟沙星铜绿假单胞菌是由于DNA促旋酶基因gyrA和gyrB基因的突变和mexAB-OprM和mexCD-OprJ表达增加共同作用的结果。     

gyrA和parC介导的铜绿假单胞菌对环丙沙星耐药机制研究

目的了解十堰地区耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌(PA)的药敏情况及gyrA和parC基因突变情况。方法用Vitek32对110株PA进行鉴定和药敏检测,对临床常用抗生素的药敏情况进行分析,琼脂稀释法测定60株耐环丙沙星(CIP)的PA对CIP的最低抑菌浓度(MIC),限制性长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测耐CIP的PAgyrA和parC基因突变情况。结果耐药菌株对哌拉西林/他唑巴坦的敏感率最高(68.3%)。在60株耐CIP的PA中有42株(70.0%)耐药菌株发生gyrA基因的83位点突变,密码子发生ACC→ATC改变,编码83位氨基酸的碱基发生突变Thr→Ile(ACC→ATC),有38株(63.3%)耐药菌株发生parC基因87位点突变Ser→Leu(TCG→TTG),同时发生两种突变的共36株(60.0%)。结论耐氟喹诺酮类PA对临床常用抗生素的敏感性降低,并呈多重耐药,药物作用靶位gyrA和parC的基因突变为其耐氟喹诺酮类药物的主要机制。     

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序,分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示,9株耐萘啶酸菌均在gyrA 83位发生有意义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),宋内志贺菌未发生parC基因突变,5株耐萘啶酸、诺氟沙星和/或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC 80位发生有意义突变AGC(Ser)→ATC(Ile)。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重,福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物,靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一,gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生,parC突变可能引起诺氟沙星和/或环丙沙星不敏感。     

鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制分析

目的 探讨鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii,Ab）对喹诺酮类药物的耐药机制。方法收集2007年11月至2008年10月全国多省市21家医院院内下呼吸道感染住院患者痰标本2698份进行培养鉴定,对Ab分离株进行药敏检测,采用聚合酶链反应对Ab的不同耐药基因进行扩增,并进行序列分析。结果2698份痰标本共计培养出39株Ab。对环丙沙星耐药率为61．54％,对左氧氟沙星耐药率为53．85％。39株Ah中有30株（76．92％）发生parC基因突变,19株（48．72％）发生gyrA基因突变,15株同时发生parC基因和gyrA基因突变。结论Ab对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA、parC基因突变有关。     

耐左氧氟沙星大肠埃希菌gyrA/gyrB/parC/parE基因突变研究

目的了解耐氟喹诺酮大肠埃希菌gyrA／gyrB／parC／parE基因突变情况。方法用Kirby—Bauer琼脂扩散法筛选耐左氧氟沙星大肠埃希菌;采用聚合酶链反应（PCR）对gyrA／gyrB／parC／parE基因进行扩增,并进行PCR扩增产物直接双向测序,分析上述基因突变情况。结果PCR扩增耐菌株gyrA／gyrB／parC／parE基因,获得目的片段,测序结果显示,氟喹诺酮耐药基因突变集中在gyrA基因83、87位ser→Leu、Asp→Asn突变;parC基因55位Ser→Leu突变,部分菌株尚存在62位Gln→Glu第二突变点;未发现gyrB、parE突变。结论靶位点gyrA和parC的改变,是本地大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药的主要机制。     

Analysis of the mechanisms of quinolone resistance in clinical isolates of Citrobacter freundii

The presence of gyrA, gyrB and/or parC mutations, quinolone uptake, outer membrane protein profiles and epidemiological relationship were studied in 12 clinical isolates of Citrobacter freundii. No alterations were observed in the gyrB gene of any of the strains, or gyrA or parC of the four quinolone-susceptible strains (nalidixic acid MIC of 2-4 mg/L, and a ciprofloxacin MIC of 0.006-0.06 mg/L). The quinolone-resistant strains were classified into two groups: one group (group A) composed of strains resistant to nalidixic acid but not to ciprofloxacin and another (group B) including those resistant to both antibiotics with a mutation at codon 83 of the gyrA gene (Thr-->Ile), but no alteration in either parC or gyrB genes. In group B, three of the four resistant isolates, with a nalidixic acid MIC > 1024 mg/L and ciprofloxacin MIC of 8-32 mg/L, showed concomitant mutations at codons 83 and 87 of the gyrA gene (Thr-->Ile and Asp-->Tyr, respectively) as well as a single mutation in codon 80 of the parC gene (Ser-->Ile). The fourth isolate did not possess the mutation at codon 87 of gyrA. Two strains belong to the same clone and, although they had the same type of mutations in the gyrA and parC genes, showed different MICs of ciprofloxacin. This difference was related to an efflux pump mechanism. Mutations in the gyrA and parC genes play the main role in quinolone resistance development in Citrobacter freundii, although other factors such as overexpression of efflux pumps can play a complementary role and thus modulate the final quinolone MIC.     

肠球菌的耐药基因研究

目的了解肠球菌属的耐药性趋势和耐药基因分布,为临床合理用药提供依据。方法采用VITEK2COMPACT全自动微生物鉴定系统对2008年1月至2012年5月间临床送检标本中分离的319株肠球菌进行鉴定和药敏试验,采用PCR方法对ermB、mef、gyrA耐药基因进行研究。结果319株肠球菌中以屎肠球菌最多205株（64．26％）,其次为粪肠球菌63株（19．75％）,其他种类肠球菌51株（15．99％）。肠球菌常用抗生素药敏结果显示屎肠球菌和粪肠球菌耐药率最低的是万古霉素（1．0％．1．6％）,其次是利茶唑胺和替考拉宁（3．9％,3．2％）,耐药率最高的是红霉素（94．6％,79．4％）。肠球菌中ermB基因阳性率为73．4％（234／319）,gyrA基因阳性率为67．1％（214／319）,reef基因均为阴性。结论肠球菌获得gyrA基因和ermB基因是肠球菌对氟喹诺酮类药物和红霉素类药物耐药的主要原因。     

鲍氏不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制及菌株同源性分析

目的探讨鲍氏不动杆菌对喹诺酮类药物耐药机制及菌株同源性分析。方法收集临床分离的喹诺酮类耐药鲍氏不动杆菌25株,采用纸片扩散法（K-B）检测其对常规药物的敏感性;采用聚合酶链反应（PCR）检测喹诺酮类耐药相关基因gyrA和parC基因,并经限制性内切酶酶切及测序方法验证;基因外重复回文序列（REP）-PCR分析菌株同源性。结果 25株鲍氏不动杆菌对12种抗菌药物呈现出多重耐药,仅对米诺环素和阿米卡星敏感,敏感率分别为48.0%和32.0%,对多黏菌素B全部敏感[最低抑菌浓度（MIC）≤2μg/mL];所有菌株检出gyrA和parC基因,25株菌株均存在gyrA基因第83位密码子TCA→TTA突变（Ser→Leu）,23株菌株存在parC基因第80位密码子TCG→TTG突变（Ser→Leu）,2株菌株存在parC基因第84位GAA→GGA突变（Glu→Gly）;REP-PCR显示,所测菌株具有很高的同源性。结论耐喹诺酮类鲍氏不动杆菌具有很高的同源性,存在gyrA和parC基因突变位点。     

上海地区肺炎链球菌对氟喹诺酮类的敏感性及其喹诺酮耐药决定区突变研究

目的了解上海地区临床分离肺炎链球菌对氟喹诺酮类等抗菌药物的敏感性，并对氟喹诺酮类敏感菌株的喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变进行初步研究。方法收集上海地区部分医院2004-2005年共176株肺炎链球菌临床分离株，用琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星等15种抗菌药物的抗菌活性，并选取部分左氧氟沙星敏感肺炎链球菌菌株进行QRDRPCR扩增、测序。结果176株受试菌株中．PSSP、PISP和PRSP各占48．9％、47．1％和4．0％，受试菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星敏感率均为100％。QRDR的扩增测序结果发现，20株左氧氟沙星MIC1～2mg／L的敏感菌株中，19株的parC、parE基因上已存在不同程度的氨基酸突变．包括ParC：Phe 105→Leu／Asp136→Tyr，Pare：Asp435→AsnjIle460→ValjAsn477→Lys．而在gyrA、gyrB基因上仅发现点突变，未导致相关氨基酸突变。结论上海地区未发现氟喹诺酮类耐药肺炎链球菌临床分离株，但左氧氟沙星MIC1～2mg／L的敏感株中已发现QRDR一级突变现象，突变的基因位点均见于parC、pare基因。     

南京地区肺炎链球菌的耐药变迁及喹诺酮耐药机制研究

目的了解南京地区肺炎链球菌临床分离株的耐药性变迁及对喹诺酮类的耐药机制。方法收集2010-2012年南京7所教学医院共147株肺炎链球菌,琼脂稀释法测定9种抗菌药物的MIC,与南京2006-2007年分离的肺炎链球菌耐药情况进行比较。并对氟喹诺酮耐药株的gyrA、gyrB、parE和parC基因喹喏酮耐药决定区域（QRDR）进行PCR扩增及测序。结果147株肺炎链球菌中,对红霉素的耐药率为89．1％;青霉素不敏感肺炎链球菌（MIC≥4mg／L）占3．4％;对头孢呋辛、头孢曲松、美罗培南、左氧氟沙星、莫西沙星的耐药率分别为26．5％、1．4％、3．4%、1．4％、0．7％;所有分离株对万古霉素、利奈唑胺敏感。与2006-2007年分离株相比,2010-2012年临床分离株对青霉素、头孢呋辛耐药率下降,对红霉素、头孢曲松耐药率变化不大,出现了少数左氧氟沙星及莫西沙星耐药株。对喹诺酮耐药株进行基因测序发现1菌株有gyrA突变（Asn167-Ile）和ParE突变（Ile460～Val）;另1菌株则有ParC突变（Ser81-Gly;Asn94-Asp）。结论南京地区肺炎链球菌对红霉素耐药率居高不下,对青霉素仍较敏感,出现了少数莫西沙星、左氧氟沙星耐药株。喹诺酮耐药株有gyrA、parE和parC的QRDR突变。