流感病毒抗原快速检测与real-time RT PCR的比较

目的介绍一种可同时检测甲型、乙型流感病毒的快速方法,便于及早确诊流感病原体。方法采用快速抗原法对2014年1月—2015年12月收集的632份流感样患者标本进行甲型、乙型流感病毒抗原检测,并对其中102份进行real-time RT PCR检测。结果快速抗原法检测到样本中甲型流感病毒阳性14例,乙型流感病毒阳性10例。real-time RT PCR法检测到甲型流感病毒阳性15例,乙型流感病毒阳性12例。快速抗原法针对甲型流感病毒诊断灵敏度93.3%,特异度100.0%;针对乙型流感病毒,诊断灵敏度83.3%,特异度100.0%,耗时15 min,明显少于real-time RTPCR法的3 h。结论采用快速抗原法可及早筛查甲型、乙型流感标本。     

多重逆转录聚合酶链反应检测常见呼吸道病毒

目的 建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法 .方法 通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测季节性甲型流感病毒(INFA)、乙型流感病毒(INFB)、人鼻病毒(HRV)和甲型H1N1流感病毒(H1N1)的多重RT-PCR方法 .结果 该法可同时或分别扩增INFA 212 bp、INFB 489 bp、HRV 380 bp和H1N1 153 bp的基因片段.检测的敏感性分别为104、104、103、104 copies/mL.采用相同的反应体系和条件,分别对其他6种常见病原体(包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌核酸)进行扩增,均未检测出扩增产物.结论 此种多重RT-PCR法适用于4种重要呼吸道病毒的快速甄别.     

肺炎衣原体荧光PCR检测方法的建立和应用

目的采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法。方法对GenBank登录的肺炎衣原体的基因序列进行生物信息学分析,针对保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR检测方法。对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测。采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价。结果本实时荧光PCR方法对甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应。本院的临床样本检出26份,其中咽拭子9份,肺泡冲洗液17份。结论肺炎支原体荧光PCR检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断。     

检测肺炎支原体的实时荧光PCR方法的建立

目的 采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法.方法 对GenBank登录的肺炎支原体的基因序列进行生物信息学分析.针对16s核糖体蛋白基因的保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR方法检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.采用倍数稀释的方法进行灵敏度的评价.对来自南方医院的522份临床咽拭子样本进行检测.结果 用实时荧光PCR方法检测甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒均无特异性反应.该方法可以检测出稀释浓度约为103/mL的肺炎支原体样本.对本院的临床样本检出39份.结论 实时荧光PCR检测肺炎支原体具有较高的特异性和灵敏度,可用于肺炎支原体感染的诊断.     

北京市丰台地区呼吸道病毒感染病原学研究

目的:了解引起北京丰台地区人群急性呼吸道感染的病毒病原。方法:RT-PCR法检测腺病毒、冠状病毒、偏肺病毒;nested-PCR检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒(PIV)、鼻病毒、肠道病毒及博卡病毒;Real-time PCR检测甲型流感病毒(IVA)(包括甲1型、甲3型、新甲流型)及乙型流感病毒(IVB)。结果:227份标本中,共有111份标本为病毒阳性,阳性检出率为48.90%。病毒阳性标本中流感病毒检出率最高,为61.26%,并以IVB为主,其次为甲3型IVA。PIV位居第二,以PIV1型为主,其次为PIV4,均为聚集性爆发。冬季的病毒检出率较其他季节高,上呼吸道感染患者的病毒检出率较其他患者高。结论:IVB是冬春季引起呼吸道感染的主要病毒病原,冬季是呼吸道病毒感染的高发季节,上呼吸道感染是病毒感染的主要途径。     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

一种快速检测甲型流感病毒的方法

目的 开发一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法（GICA）的试剂盒，以用于对甲型流感病毒的检测。方法以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗甲型流感病毒内部抗原的单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被两种抗甲型流感病毒单克隆抗体的混合液，制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合，后移动至硝酸纤维素上与固定的单克隆抗体发生反应，形成肉眼可见的红色带。结果GICA试纸条与甲1型和甲3型流感病毒共16种毒株均能发生特异性反应，与乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒无交叉反应。用三种不同甲型流感病毒毒株的不同浓度标本与美国同类经过FDA批准的产品比较，灵敏度相同。结论GICA试纸条灵敏度能够达到临床使用的要求，并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点，对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。     

九项呼吸道病原体IgM抗体联合检测的临床意义

目的：为了解我院住院患者呼吸道病原体的感染状况,为临床提供一种快速诊断呼吸道感染病原体的方法。方法：对3 449例呼吸道疾病患者运用九项呼吸道联检试剂同时检测9种病原体的IgM抗体,包括嗜肺军团菌（LP）、肺炎支原体（MP）、Q热立克次体（QFR）、肺炎衣原体（CP）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型流感病毒（IFA）、乙型流感病毒（IFB）和副流感病毒1、2和3型（PIVS）。结果：3 449例呼吸道疾病患者总感染率为30.3%,其中以肺炎支原体最为常见,占13.38%,其次为乙型流感病毒,再次为呼吸道合胞病毒。混合感染率达14.4%（495/3 449）;感染人群以儿童和老人多见,多为肺炎支原体合并乙型流感病毒感染,2~4岁年龄段感染率差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：肺炎支原体、乙型流感病毒是呼吸道疾病中非典型病原体的主要病原体,临床表现不特异,应重视多种病原体联合检测,以免漏诊误诊,以达到快速诊断的目的。     

895例儿童急性呼吸道感染病原体检测与分析

目的:分析武汉市儿童医院中医科住院儿童常见呼吸道病原体的检测结果,为临床诊疗提供依据.方法:收集895例诊断为ARI患儿的血清标本,采用间接免疫荧光法检测其中8种常见病原体的IgM抗体.结果:895例患儿中抗体阳性327例,阳性率为36.5%,病原体检出率与在各年龄组中存在差异;病原体中支原体阳性率最高,其他依次为乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、嗜肺军团菌血清Ⅰ型、甲型流感病毒、Q热立克次体;混合感染151例,占46.2%,主要是两种病原体混合感染.结论:病原体检出率与年龄有关系;支原体、乙型流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒是引起儿童急性呼吸道感染的主要病原体;混合感染主要是支原体合并其他病原体感染.     

呼吸道九联检试剂在儿童呼吸道感染病原体检测中的临床意义探讨

目的探讨呼吸道九联检试剂在儿童呼吸道感染病原体检测中的临床意义。方法对1 516例儿童呼吸道感染患者的血清标本应用呼吸道九联检试剂(间接免疫荧光法)同时检测九项主要病原体的Ig M抗体,包括嗜肺军团菌、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒。结果病原体感染率为35.5%(537/1 516),其中以肺炎支原体最为多见,其他依次为腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒。混合感染率达11.2%(170/1 516)。结论九项呼吸道联检试剂检测快速,操作简便,尤其对儿童急性呼吸道感染准确率高,适用于大型医院儿科患者快速检测。     

一步法多重RT-PCR快速筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒

目的 建立能同时筛查A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒的多重RT-PCR技术.方法 针对A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因设计通用扩增引物,针对新型甲型H1N1流感病毒的HA基因设计特异性扩增引物,采用一步法建立多重RT-PCR反应体系.通过盲法实验与实时荧光RT-PCR进行比对来评价方法的准确性,并应用于临床评价方法的实用性和有效性.结果 琼脂糖凝胶电泳分析多重RT-PCR产物,结果显示目的扩增片段条带清晰明亮,没有非特异性产物出现,可见该方法扩增效率高,特异性强.50份样本的盲法实验结果显示两种方法检测结果完全一致,符合率为100%.结论 建立的多重RT-PCR方法能通过一次实验快速、准确地同时筛检A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒,是一项成本低廉、对流感的疫情监测和早期诊断具有实用价值的筛检技术.

Abstract：

Objective To developed a multiplex RT-PCR assay for simultaneous screening of type A, B and novel A (H1N1)influenza viruses. Methods Two pairs of universal primers in were designed for amplifying the M gene and NS gene of type A and B influenza viruses, respectively. A pair of specific primers of HA gene was designed to detect novel A (H1N1) influenza virus. A one-step method was used to establish the multiplex RT-PCR system. A blinded experiment was carried out to validate the accuracy of this assay in comparison with the results of real-time fluorescence RT-PCR. The clinical practicability and efficacy of this assay was also evaluated. Results The RT-PCR products were analyzed using agarose gel electrophoresis,which yielded distinct bands of the target fragments without non-specific reactions, suggesting the high efficiency and specificity of the multiplex RT-PCR. Blinded study of 50 samples demonstrated a concordance rate of 100%. Conclusion This multiplex RT-PCR assay allows one-step simultaneous detection of type A, B and novel A (H1N1) influenza viruses rapidly and accurately, and provides a valuable low-cost screening technique for influenza epidemic monitoring and early diagnosis.     

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。     

0～2岁婴幼儿呼吸道病毒监测及临床特征分析

目的 了解绍兴市妇幼保健院0～2岁婴幼儿急性呼吸道感染病毒病原学构成及临床特征,为临床诊疗提供参考。方法 2011年10月—2013年9月绍兴市妇幼保健院住院的呼吸道感染患儿共3677例。采集每例患儿鼻咽吸取物1份,用荧光免疫方法进行病毒检测,包括呼吸道合胞病毒、流感病毒A和流感病毒B、副流感病毒1、2、3、腺病毒。结果 总的病毒阳性检出率25.40%。检出率较高的前3位病毒分别为呼吸道合胞病毒55.03%（514/934）,其流行月份在1～2月和11～12月;副流感病毒3,占17.24%（161/934）,其流行月份在5～8月;流感病毒A,占10.06%（94/934）,其流行月份在3～5月。0～3月患儿主要感染呼吸道合胞病毒（22.84%）,1～2岁患儿流感病毒A感染（3.82%）及腺病毒感染（3.73%）也较常见。呼吸道合胞病毒主要引起肺炎及毛细支气管炎,临床表现以咳嗽、气喘为主;流感病毒A、腺病毒主要引起上呼吸道感染,临床表现以发热为主。结论 病毒是0～2岁婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原,以呼吸道合胞病毒、副流感病毒3较为多见,其感染存在季节性特征,临床特征有差异,在临床诊疗时应加以注意。     

2011-2013年龙岗区常见7种呼吸道病毒监测结果分析

目的对龙岗区呼吸道病毒感染病例样品进行检测,并对其流行特征进行分析。方法在区内哨点医院采集呼吸道感染病例咽拭子889份,用实时荧光定量PCR法对流感病毒(A型、B型)、腺病毒(ADV)、人鼻病毒(HRV)、副流感病毒(PIV-1、PIV-2和PIV-3亚型)、呼吸道合胞病毒(RSV-A和RSV-B亚型)、冠状病毒(CoV-229E、CoV-OC43、CoVNL63和CoV-HKU1亚型)和人偏肺病毒(hMPV-A和hMPV-B亚型)共7种呼吸道病毒15个亚型进行检测。结果流感病毒是龙岗区最常见的呼吸道感染病原,其次是人鼻病毒;1~7月呼吸道病毒阳性率保持较高水平;≤5岁儿童对各种病毒易感;鼻病毒和腺病毒是混合感染中最常见的病原。结论应继续加强常见呼吸道病毒的监测,对呼吸道传染病的预防和控制具有重要意义。     

哈尔滨地区住院患者呼吸道病毒感染的病原学研究

目的 调查哈尔滨地区住院患者常见呼吸道病毒感染的病原学和流行病学特征,为疾病预防和治疗提供参考.方法 采用直接荧光免疫法,对2009年8月至2010年9月521例呼吸科住院患者的痰标本进行病毒检测.结果 病毒检测阳性者74例,总体阳性率14.2％.在阳性感染者中,单一病毒感染数为39,混合病毒感染累计数为79,合计118.阳性标本中呼吸道合胞病毒44例(37.3％)、腺病毒6例(5.1％)、甲型流感病毒37例(31.4％)、乙型流感病毒9例(7.6％)、Ⅰ型副流感病毒12例(16.2％)、Ⅱ型副流感病毒1例(0.8％)、Ⅲ型副流感病毒9例(7.6％).呼吸道病毒感染季节上存在统计差异,在性别、疾病和年龄没有统计学差异.结论 哈尔滨地区住院患者呼吸道病毒感染的病原体以呼吸道合胞病毒为主,其次是申型流感病毒.     

一种快速诊断呼吸道合胞病毒感染的方法

应用引物设计原则，选择呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）基因组中高度保守的Ｆ基因作为扩增靶序列，独立设计合成了两对引物，建立了一个逆转录套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＲＳＶＲＮＡ的方法。结果：对引物进行敏感度实验，其检测敏感度为每ｍｌ１０ＴＣＩＤ５０ｓ（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）的病毒量；用副流感病毒１型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒和腺病毒２型作对照，均无预期扩增产物出现，证实了设计引物的特异性；用建立的逆转套式ＰＣＲ方法对５例急性下呼吸道感染患儿的鼻咽部分泌物标本进行检测，发现３例阳性，２例阴性；同时用病毒培养法检测，结果完全相同。提示：该方法具有快速、敏感、特异和观察结果客观等优点。     

核、膜蛋白的基因能抑制禽类流感病毒及其重组株的繁殖

对人流感病毒A/Udorn/72(H_3N_2)株与禽类流感病毒A/Mallard/NY/78/(H_2N_2)重组后的重组株分析表明,仅含禽类病毒的核蛋白(NP)或膜蛋白(M)的RNA片段的重组株,在松鼠猴的呼吸道繁殖是受限制的。另外。仅有禽类的RNAl和NS基因的重组株(Clone 12)在松鼠猴的气管内的繁殖也明显受限制,而只具有其中一个基因的Clone 9, Clone 2, 则限制就不明显。由此表明,禽类流感病毒的NP和M基因在宿主范围的繁殖限制中起主要作用,而RNAI和SN基因的结合,同样起着繁殖受限制作用。     

Respiratory viruses detected in hospitalised paediatric patients with respiratory infections

Over 200 strains of respiratory viruses cause a variety of human infections ranging from common cold to life-threatening pneumonia. Respiratory viruses implicated in this study are respiratory syncytial viruses (RSV), adenovirus, influenza viruses and parainfluenza viruses. The objective of this study is to determine the epidemiology of respiratory viruses in paediatric patients with lower respiratory tract infection. The methods used were direct antigen detection method, shell vial culture method and conventional tube culture method. The samples included in this study are paediatric patients seen in Universiti Kebangsaan Malaysia Hospital, Kuala Lumpur with suspected acute viral respiratory infection, presenting with acute laryngotracheobronchitis (croup), bronchiolitis and pneumonia. Nasopharyngeal aspirates were collected and processed almost immediately. A total of 222 specimens were received during February 1999 to January 2000 showing a dual peak pattern in the months of April and December. The mean age of the patients was 13 months. Pneumonia (77.9%) was the most common clinical diagnosis in children with lower respiratory tract infection. This was followed by bronchiolitis (19.4%) and croup (27%). Viral aetiologies were confirmed in 23.4% of the patients. The most common respiratory virus isolated or detected was RSV, followed by parainfluenza viruses, influenza viruses and adenovirus.     

人类博卡病毒致成人急性呼吸道感染的临床研究

目的：探讨人类博卡病毒（HBoV）致成人急性呼吸道感染（ARI）的临床特征,分析成人病毒性肺炎与HBoV感染的相关性。方法收集2013年5月至2014年1月在北京中医药大学东方医院感染科发热门诊就诊的81例ARI患者的鼻咽拭子,应用多重RT-PCR及PCR技术进行HBoV、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、鼻病毒（RhV）、流感病毒（Flu）、副流感病毒（PIV）、人类偏肺病毒（hMPV）、人冠状病毒（HCoV）、肠道病毒等9种病毒及肺炎支原体、肺炎衣原体的核酸检测,分析HBoV致成人ARI的临床特点。结果 HBoV阳性14例（17.3％）,其中10例（71.4%）为肺炎,4例（28.6%）为上呼吸道感染。 HBoV单独感染10例,混合感染4例。 HBoV感染者咳嗽10例（71.4%）,咳嗽伴喘憋1例（7.1%）,咯痰6例（42.9%）,发热14例（100.0%）,肺部闻及湿性啰音者4例（28.6%）。外周血白细胞正常或降低者11例（78.6%）,升高者3例（21.4%）。10例肺炎患者胸部X线片表现为斑片状模糊影9例,大片致密影1例。单侧肺炎7例,双侧肺炎3例,病变均位于中下肺叶。重症肺炎1例,为HBoV混合感染ADV及肺炎支原体。结论 HBoV是引起成人ARI的病原体之一,感染部位以下呼吸道为主。     

广州地区流感病毒和人博卡病毒感染的流行病学调查

【目的】 调查2010-2011年广州地区发热呼吸道感染病人的流感病毒(IFV)和人博卡病毒(HBoV)的流行状况和流行特点。【方法】 采集2010-2011年广州市5家哨点医院共3 460例符合条件的有发热伴呼吸道感染症状患者的咽拭子标本,同时进行相关临床信息的收集和分析,采用普通和巢式PCR方法检测IFV和HBoV的核苷酸,分析IFV和HBoV的流行情况和时间、人群分布特点,对IFV和HBoV均为阳性的样本进一步进行副流感病毒等5种常见呼吸道感染病毒的检测,以了解多重感染的状况。【结果】 3 460例病例中,IFV和HBoV的阳性检出率分别为21.13%和1.68%;731例IFV阳性标本中,甲、乙、丙型流感病毒(FluA、B、C)的比例为558∶172∶1,其中481例(66.75%)诊断为上呼吸道感染,58例HBoV阳性病例中44例诊断为下呼吸道感染(75.86%),IFV和HBoV病毒的检出均与年龄关联,检出率最高的年龄组分别为15 ~ 34岁和0.5 ~ 1岁,IFV和HBoV的发病高峰分别为7~8月和5~6月,5例检出HBoV与IFV的混合感染,混合感染率为0.64%,其中1例为IFV、HBoV和人冠状病毒(HCoV)的三重感染,HBoV阳性的成人患者的混合感染率为50%。【结论】 2010-2011年甲型流感病毒仍是广州地区发热呼吸道症候群的主要病原之一,青壮年检测率较高,夏季为流行高峰;人博卡病毒为全年散发,5-6月发病率较高,婴幼儿中发病率较高,成人病例中人博卡病毒与流感病毒的混合感染率较高。