反义miR-155对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察敲低微小RNA-155(miR-155)的表达对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响.方法 脂质体介导转染miR-155反义抑制序列(AS-miR-155)下调入胶质瘤U251细胞中miR-155的表达,同时设未转染组和无义序列转染组.实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测转染后细胞miR-155的表达,四甲基偶氨唑盐(MTT)实验检测转染后细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)检测转染后细胞周期变化和凋亡情况.结果 与未转染组和无义序列转染组相比,miR-155 反义抑制序列转染组细胞miR-155表达下降;MTT实验结果显示细胞生长受抑;流式细胞术结果可见细胞出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率增高.结论 反义miR-155可抑制U251胶质瘤细胞生长增殖,促进其凋亡.miR-155可能成为治疗胶质瘤的候选靶标.     

反义miR-21抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖的体外研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖能力的效果和机制.方法 脂质体介导转染反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)下调U251人脑胶质瘤细胞株miR-21的表达.使用实时定量PCR和原位杂交法鉴定转染后U251细胞miB-21表达水平下调;MTY法评价AS-miR-21抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布和凋亡;采用细胞免疫荧光技术(PCNA、CyelinD1、Bcl-2、PTEN和Septin-7)评价转染后U251细胞肿瘤生物学性状改变.结果 MTT结果显示AS-miR-21转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组与无义寡核苷酸(F=78.926,P=0.000)组;实时定量PCR法:AS-miR-21转染组miR-21表达下调为对照组0.042±0.012;LNA-miR-21原位杂交显示AS-miR-21转染组miR-21表达水平较对照组与无义寡核苷酸组下调;流式细胞术检测可见AS-miR-21转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞(X2=14.160,P=0.007)且凋亡比例高于对照组与无义寡核苷酸组(F=23341.25,P=0.000);细胞免疫荧光法表明AS-miR-21治疗后U251细胞PCNA、CyclinD1、Bcl-2表达下调,PrEN、Septin-7表达上调.结论 以miR-21作为靶点抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长结果肯定,miR-21可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

miR-93在脑胶质瘤的表达及其对胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖的影响

目的 探讨miR-93在脑胶质瘤的表达及其对胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖的影响。方法采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测61例脑胶质瘤组织及正常脑组织的miR-93表达水平。构建慢病毒载体,转染抑制胶质瘤细胞系U87、U251中miR-93的表达。检测转染后24、48、72、96 h的胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖和克隆形成数。结果 61例胶质瘤组织标本中,44例(72. 1%) miR-93表达水平明显高于正常脑组织。其中WHOⅠ级胶质瘤的阳性表达率为20%(1/5)、Ⅱ级为71. 4%(15/21)、Ⅲ级为73. 3%(11/15)、Ⅳ级为85%(17/20)。miR-93在WHOⅠⅣ级胶质瘤组织的表达值分别为1. 25、5. 91、6. 71、31. 20。转染抑制U251、U87细胞的miR-93表达后,细胞的增殖活性明显被抑制(均P 0. 05),并且U251、U87细胞的克隆形成能力明显降低(均P 0. 01)。结论 miR-93在脑胶质瘤中的表达水平较正常脑组织明显增高,且与胶质瘤的分级相关; miR-93能促进胶质瘤细胞的增殖。     

Rap2a在胶质瘤中的表达及其意义

目的探讨Rap2a在胶质瘤中的表达及其意义。方法应用Western blot检测Rap2a在胶质瘤组织中的表达情况;在胶质瘤细胞U251、U87中转染Rap2a质粒,应用细胞克隆形成实验和Ed U实验检测过表达Rap2a对U251、U87细胞增殖的影响;应用流式细胞术检测过表达Rap2a对U251、U87细胞周期的影响。结果 Rap2a在胶质瘤组织中呈低表达;过表达Rap2a抑制了U251、U87的增殖;过表达Rap2a明显使细胞U251、U87的细胞周期阻滞在G0/G1期。结论 Rap2a的蛋白表达水平在胶质瘤组织中表达下调,过表达Rap2a抑制胶质瘤细胞的增殖能力。     

过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。     

p53基因、PTEN基因协同对胶质瘤U251细胞系生长抑制作用的研究

目的探讨p53基因和PTEN基因在脑胶质瘤细胞系U251发生发展过程中的作用机制。方法用不同MOI的p53腺病毒表达载体pAdCMV-p53及空载体pAdCMV-lacZ分别感染表达野生型PTEN基因和突变型PTEN基因的细胞系,RT-PCR及Westernblot方法检测转染效率;并通过MTT检测生长抑制率、流式细胞仪检测细胞周期及TUNEL检测分析细胞凋亡等指标观察p53基因及PTEN基因对U251细胞生长的影响。结果MOI为100时,p53基因可引起U251细胞G0G1期阻滞、诱导细胞凋亡,生长抑制;MOI为50时,U251-p53 PTEN生长抑制率明显高于U251-p53,并能出现细胞凋亡,而U251-p53仅出现少量细胞凋亡。结论p53基因可以通过细胞周期G0G1期阻滞及诱导细胞凋亡抑制胶质瘤细胞系U251的生长;PTEN基因可以促进p53基因对胶质瘤细胞系U251的生长抑制作用,并能增加U251细胞对p53基因诱导凋亡的敏感性。     

I型γ-分泌酶抑制剂对恶性胶质瘤细胞株增殖及凋亡的影响

目的 探讨I型γ-分泌酶抑制剂(GSI-I)对U87、U251胶质瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用.方法 应用GSI-I作用于U87、U251胶质瘤细胞,通过MTT法观察GSI-I对上述两种细胞的增殖抑制作用,通过流式细胞仪检测GSI-I对该两种细胞细胞周期的影响及诱导凋亡的作用.结果RT-PCR及实时定量荧光RT-PCR结果显示,GSI-T可明显抑制胶质瘤细胞中Notch通路的活性,主要体现为Notch通路的靶基因Hes-1表达明显下调.MTT检测结果显示2.5μmol/L及以上浓度的GSI-I对U87及U251胶质瘤细胞有明显的增殖抑制作用.与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且该抑制作用呈剂量依赖型增加.流式细胞检测结果显示GSI-I主要使U87胶质瘤细胞的细胞周期阻滞在G1期而抑制细胞增殖,对于U251胶质瘤细胞则主要通过诱导凋亡来抑制增殖.结论 GSI-I可明显抑制U87及U251胶质瘤细胞的增殖并诱导凋亡,为恶性胶质瘤的临床治疗提供了理论参考依据.     

下调RNF138基因对胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡及细胞周期影响的研究

目的探讨RNA干扰下调胶质瘤细胞株高表达基因RNF138对胶质瘤细胞株U251体外增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法构建下调RNF138基因的siRNA,通过慢病毒转染导入胶质瘤细胞株U251,设立阴性干扰对照组及空白对照组,荧光显微镜观察转染效率;实时荧光定量PCR检测敲减效率;运用Cellomics仪器连续检测U251体外增殖情况;流式细胞仪检测U251凋亡及细胞周期变化情况。结果慢病毒载体高效、稳定转染U251细胞,靶向RNF138的siRNA有效抑制RNF138基因表达,使RNF138mRNA表达减少60%,U251体外增殖明显减缓,凋亡明显增加,细胞阻滞在G2/M期。结论 RNA干扰抑制RNF138基因表达可以明显抑制胶质瘤细胞株U251体外增殖,促进其凋亡,影响细胞周期,阻滞细胞分裂。     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

反义miR-21通过调控hTERT表达抑制胶质瘤细胞生长

目的探讨敲低miR-21表达对人胶质瘤细胞系U87细胞功能的影响以及相关作用机制。方法脂质体介导转染miR-21反义寡聚核苷酸（miR-21 inhibitor）敲低U87细胞miR-21的表达。使用实时荧光定量PCR鉴定转染后U87细胞miR-21表达水平;MTT法检测转染后细胞增殖水平,流式法评价转染后细胞周期分布及凋亡变化,并结合Western印迹及RT-PCR验证在U87细胞中miR-21和hTERT间关系。结果体外转染反义miR-21寡聚核苷酸能明显抑制U87细胞生长,诱导其凋亡,并且能够明显下调hTERT表达。结论反义miR-21可能通过下调hTERT表达抑制胶质细胞生长,miR-21可作为胶质瘤基因治疗的靶点。     

靶向PTTG1基因的微小RNA转染后诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的研究

目的 构建表达靶向抑制垂体瘤转化基因1 (PTTG1)基因表达的RNA干扰载体microRNA,导入人脑胶质瘤细胞株U251中,研究靶向抑制PTTG1基因对U251细胞的凋亡诱导作用.方法 以PTG1为靶基因,根据pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体要求,设计针对PTIG1的microRNA序列,脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,采用荧光定量多聚酶链反应(PCR)以及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;膜联蛋白Ⅴ与碘化丙啶(annexinⅤ/PI)双色标记的流式细胞仪法检测microRNA诱导的细胞凋亡,碘化丙锭(PI)染色检测细胞周期阻滞.结果 实时荧光定量PCR以及Western blot检测显示,PTTG1基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;转染后,流式细胞仪检测分析显示,PTTG1基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论 靶向PTTG1基因的重组microRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PTTG1介导的RNAi显著靶向抑制了PTTG1基因在人脑胶质瘤细胞中的表达,并明显地诱导了脑胶质瘤细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

miR-153下调FOXR2、CDK8和CDK13的表达抑制胶质母细胞瘤细胞增殖

目的 探讨miR-153对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响。方法 体外培养胶质母细胞瘤细胞系U87、U251、SHG-44和T98G细胞,分别转染miR-153质粒（miR-153组）、空载质粒（载体组）和miR-153突变质粒（miR-153突变组）,另设置空白对照组（不转染任何质粒）。RT-PCR检测miR-153、FOXR2、CDK8和CDK13的表达,MTT法检测细胞增殖能力。结果 miR-153组U87、U251、SHG-44和T98G细胞miR-153表达水平较载体组和空白对照组显著上升（P<0.05）,细胞增殖水平较载体组和空白对照组均显著降低（P<0.05）。miR-153组U87、U251、SHG-44和T98G细胞FXOR2、CDK8和CDK13的mRNA水平较miR-153突变组、载体组和空白对照组均显著下降（P<0.05）,而后三组之间均无统计学差异（P>0.05）。结论 miR-153抑制胶质母细胞瘤细胞增殖,其机制可能与抑制FXOR2、CDK8和CDK13表达有关。     

LRIG2基因全长及胞外段对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2（LRIG2）基因全长及胞外段对脑胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法将LRIG2全长,LRIG2胞外段（LRIG2_ecto）及空白质粒（对照）经慢病毒法分别转染胶质瘤细胞系U251细胞,筛选稳定细胞株,实时PCR及免疫印迹法检测mRNA及蛋白表达,细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖,流式细胞分析检测细胞周期及细胞凋亡。结果两转染组Flag标签蛋白表达成功;两转染组LRIG2全长及LRIG2_ectomRNA表达较对照组明显升高（氏0．01）;两转染组细胞增殖率均明显高于对照组（P〈0．01）;两转染组s期与G2/M期细胞数之和（即细胞增殖指数）均明显高于对照组（P〈0．01）,而细胞凋亡率均明显低于对照组（P〈0．05）。结论LRIG2基因全长及LRIG2_ecto促进胶质瘤细胞增殖,并将细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞凋亡。     

siRNA靶向下调nNav1.5影响胶质瘤细胞增殖与凋亡研究

目的研究下调电压-门控钠离子通道(VGSCs)幼稚型钠离子通道1.5(n Nav1.5)的表达对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响。方法用免疫荧光技术检测n Nav1.5在U251细胞的表达;设计合成n Nav1.5的靶向小干扰核糖核酸(siRNA),脂质体瞬时转染至U251细胞,用实时定量逆转录酶-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测n Nav1.5的mRNA和蛋白水平变化,并判断siRNA干扰效果;用四唑盐比色法(MTT)和流式细胞仪检测siRNA对细胞增殖和凋亡的影响。结果 n Nav1.5主要在U251细胞核中表达;siRNA可显著下调n Nav1.5的mRNA和蛋白表达水平,并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。结论 n Nav1.5在胶质瘤的发生发展过程中起着促进作用,可能成为胶质瘤诊断和治疗的一个新靶点。     

miR-127-3p通过下调靶基因MAPK4抑制神经胶质瘤增殖的机制研究

目的 探讨miR-127-3p在神经胶质瘤中的表达水平差异及生物学作用。方法 用RT-PCR法检测神经胶质瘤患者及健康人群脑脊液中miR-127-3p相对表达水平; 用RT-PCR法检测人神经胶质瘤细胞株和人正常神经胶质细胞中的miR-127-3p相对表达水平; 用瞬时转染法上调神经胶质瘤细胞U251中的miR-127-3p相对表达水平,用MTT法检测细胞增殖,用流式细胞术检测细胞凋亡,用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、Mcl-1和bax表达水平; Targetscan等在线靶基因预测软件预测miR-127-3p的靶基因,并采用双荧光素酶报告试验和Western blot验证miR-127-3p与靶基因之间的直接作用关系。结果 神经胶质瘤患者(1.33±0.12)脑脊液中的miR-127-3p相对表达水平低于健康人群(3.62±0.26)(t=5.867,P=0.004); U251(0.59±0.05)、U373(0.96±0.08)、U87(0.77±0.03)、SHG44(1.28±0.05)中miR-127-3p相对表达水平均低于人脑正常胶质细胞株HEB(3.64±0.26)(P<0.01); 转染后24、48、72 h 150组、100组和50组细胞吸光度值均低于对照组(P<0.05),并且随着miR-127-3p mimics转染水平增高,U251细胞吸光度值越低; miR-127-3p mimics转染组(39.3±4.6%)细胞早期凋亡率高于对照组(7.2±0.6%)(P<0.05); miR-127-3p mimics转染组(9.3±2.3%)细胞晚期凋亡率高于对照组(2.4±0.5%)(P<0.05); mimic转染组(0.119±0.008)U251细胞bcl-2蛋白表达水平低于对照组(0.556±0.039),mimic转染组(0.168±0.015)U251细胞bax蛋白表达水平高于对照组(0.086±0.006),mimic转染组(0.144±0.009)U251细胞Mcl-1蛋白表达水平低于对照组(0.426±0.028)(P均<0.05); 双荧光素酶报告基因实验显示,只有当MAPK4-WT-3' UTR与miR-127-3p mimic共同转染时荧光素酶活性被抑制,这提示miR-127-3p能与MAPK4直接结合,miR-127-3p mimic转染组(0.121±0.003)U251细胞MAPK4蛋白表达水平低于对照组(0.467±0.028)(P<0.05)。结论 miR-127-3p在神经胶质瘤患者脑脊液中呈低表达,上调miR-127-3p能抑制神经胶质瘤U251细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与调控Bcl凋亡相关基因及抑制靶基因MAPK4有关。     

RNA干涉CD44基因抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖与侵袭性研究

目的通过合成靶向分化抗原簇44(CD44)基因的siRNA片段,下调CD44在脑胶质瘤细胞U251中的表达,揭示其在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法根据CD44基因序列设计并合成的siRNA片段转染U251细胞,利用荧光实时定量(qRT-PCR)检测细胞中CD44基因mRNA水平的变化;蛋白印迹实验(Western blot)检测CD44基因蛋白水平的变化;四甲基偶氮唑蓝染色(methyhhiazolyl tetrazolium,MTT)法检测U251细胞增殖;单细胞划痕愈合实验、Transwell小室侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力变化。结果体外合成的CD44-siRNA能有效抑制U251细胞中CD44基因在mRNA水平与蛋白水平的表达(P0.05),并抑制细胞的增殖(P0.05)和迁移侵袭能力(P0.05)。结论 CD44-siRNA能够有效抑制U251脑胶质瘤细胞的增殖及其迁移侵袭力,为以CD44为靶点的肿瘤基因治疗奠定了基础。