铜绿假单胞菌随机扩增多态性DNA指纹法基因分型研究

建立了铜绿假单胞菌（ＰＡ）随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）指纹图基因分型方法，并应用于流行病学相关或不相关的７５个ＰＡ菌株的基因分型。分型率为１００％。３２株新生儿暴发感染菌株，可分成４个血清型和５个ＲＡＰＤ谱型，其中２５株属于同一谱型。在８例患者的垂直追踪菌株中，除有１例其第１和第３个分离株的血清型和ＲＡＰＤ谱型均相同，但与第２个分离株的血清型和ＲＡＰＤ谱型不同外，其余７例前后菌株的谱型相同。１３株散发菌株可分成３个血清型和１０个ＲＡＰＤ谱型；１２株流行病学无关菌株的ＲＡＰＤ谱型均不相同。本研究结果表明，ＲＡＰＤ指纹图基因分型法具有分型率高、分辨力强、比较快速简便等优点，并且不需要已知核酸序列，是在分子水平上对微生物感染的病原学、发病机理及流行病学研究的较理想的方法。     

铜绿假单胞菌的GM-PFGE分型的研究

目的研究全基因组ＤＮＡ稀有位点限制性内切酶酶切脉冲电场电泳图谱（ＧＭ－ＰＦＧＥ）在铜绿假单胞菌基因分型中的应用,并与表型分型比较。方法对１个月内来自两个医院的病人及环境的２０株铜绿假单胞菌进行了ＧＭ－ＰＦＧＥ图谱分析,同时进行３０种生化反应的统计分型、２３种药物的敏感性分型、胞外脂多糖的血清抗原分型;并利用数值分类软件包进行相关性比较研究。结果临床致病铜绿假单胞菌的生化表型基本稳定,但其药物抗性的获得与丢失较为明显。血清型、生化性状及药物抗性之间无明显对应关系。当２菌株ＧＭ－ＰＦＧＥ图谱条带相似系数大于８０％时,为同一菌株的不同克隆亚型,当相似系数在２５％～７０％之间时,则为不同菌株。结论ＧＭ－ＰＦＧＥ分析可显示染色体结构的区域多型性,其重复性好,分辨率明显高于表型分型,结果可靠,必将成为铜绿假单胞菌或其它病原微生物分子流行病学研究的有力工具。     

三种检测铜绿假单胞菌AmpC酶方法的评价

目的探讨一种简便易行，适用于临床微生物实验室常规开展检测AmpCβ内酰胺酶（简称AmpC酶）的方法。方法对临床分离的150株铜绿假单胞菌用表型筛选试验作AmpC酶测定，对AmpC酶阳性菌株同时进行氯唑西林双纸片协同试验、氟氯西林（FCC）双抑制剂扩散协同试验、PCR基因检测。用基因检测来评价比较三种测定方法的检出率及差异。结果表型筛选试验AmpC酶阳性37株同时进行氯唑西林双纸片协同试验、氟氯西林双抑制剂扩散协同试验、基因检测，检测出阳性株分别为15、14、11株，阳性率分别是40．54％（15／37）、37．84％（14／37）、29．73％（11／37）。表型筛选试验与后三种方法比较差异有统计学意义（P〈0．01），后三种方法结果比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论氯唑西林双纸片协同试验、氟氯西林双抑制剂扩散协同试验检测AmpC酶特异性较表型筛选试验高，且操作简便、结果可靠，适合临床实验室常规检测应用。     

耐环丙沙星铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的 了解本地区铜绿假单胞菌的耐药情况及超广谱β-内酰酶（ESBLS）的检出率，以指导临床合理用药。方法对90株临床分离菌用纸片扩散法（K-B法）进行药物敏感性试验；纸片扩散表型确证法进行ESBLS检侧。结果本地区铜绿假单胞菌对氨苄西林、萘啶酸、哌拉西林、头胞噻肟、头胞吡肟、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星、氨曲南、头胞他啶、亚胺培南、头胞呋辛的耐药率分别是90．0％、83．3％、77．2％、29．4％、5％、8．9％、65．0％、60．0％、62．2％、50．0％、7．2％、18．3％、0、47．2％；ESBLS的检出率为24．4％。结论本地区铜绿假单胞菌耐药情况不容乐观且多重耐药菌株较多；氟喹诺酮药物之间交叉耐药明显；产ESBLS率较高。     

临床分离铜绿假单胞菌β-内酰胺类耐药相关基因的研究

目的 调查临床分离铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugirtosa，Pa）β-内酰胺类耐药相关基因的流行状况。方法 采用VITEK-32全自动微生物系统对26株临床分离的Pa进行抗生素敏感试验，PCR方法检测11种β-内酰胺酶和外膜蛋白oprD2编码基因。结果 26株PaTEM、IMP、OXA的阳性率分别为42．3％、30．8％、3．8％，oprD2基因缺失高达92．3％，而SHV、CTX-M-1、PER、VEB、GES、VIM、DHA、MIR基因均阴性。结论 我院临床分离Pa对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因为产TEM、IMP型β-内酰胺酶和缺失外膜蛋白oprD2。     

铜绿假单胞菌主动外排系统研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种重要的院内感染条件致病菌，常常感染癌症病人、严重烧伤和AIDS患者等免疫力低下的病人，且由于它具有先天的和后天获得的多药耐药性(multidrug resistance．MDR)．临床治疗十分困难，一旦感染，死亡率很高．已经成为临床医生面临的治疗难题之一。近年来的研究发现，PA内存在着外排多种物质的的主动外排系统，在MDR中起着极其重要的作用。下面就对铜绿假单胞菌的主动外排系统研究进展进行综述。     

生物膜铜绿假单胞菌对小白鼠的致病作用

目前生物膜菌感染的治疗是临床亟待解决的课题 ,因此对生物膜菌的致病机理需要深入的研究 ,才能有效的治疗生物膜菌引起的感染。对 6周龄、雄性清洁级小鼠 ,分别用铜绿假单胞菌悬液和生物膜状态的铜绿假单胞菌在小鼠气管内接种 ,进行 3项试验 :①以细菌浓度为 5× 10 6ＣＦＵ ｍｌ接种 2 0 μｌ 只测定鼠肺泡灌洗液 (ＢＡＬＦ)中白细胞数 ,结果见表 1。 2种细菌接种后ＢＡＬＦ中的白细胞数差异有显著性 (Ｐ <0 .0 1)。②测定 2组感染小鼠的存活率每组 30只小鼠分别将 10 6ＣＦＵ ｍｌ的 2组菌液 2 0 μｌ 只接种到鼠气管内 ,观察 10ｄ小鼠存…     

应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达

目的 观察siRNA干扰质粒转入铜绿假单胞菌后,MexB蛋白表达量的变化.方法 针对mexB基因设计合成特异性siRNA分子,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/NeosiRNA重组质粒.构建重组表达质粒pET22b+/mexB,并转化大肠杆菌BL21( DE3) plysS,诱导表达MexB蛋白,蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体.siRNA质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株,运用Western blot观察转化8、12、24h后MexB蛋白表达量的变化.结果 成功构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒.成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB,并制备多克隆兔抗.siRNA质粒对铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果,而且沉默效果存在时间差异性.结论 siRNA质粒转化3株铜绿假单胞菌后,在8h及12 h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少,而在24 h时MexB蛋白表达量无改变.     

检测铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶方法比较

目的：探讨检测金属β-内酰胺酶的可靠方法。方法：收集临床分离耐亚胺培南的铜绿假单胞菌8株及产IMP-1金属争内酰胺酶标准株一株,分别采用纸片增效法和双纸片协同实验检测金属酶表型,比较其结果。结果和结论：纸片增效法容易出现假阳性结果,而纸片协同法是相对可靠的检测金属酶的方法。     

铜绿假单胞菌的药物敏感试验结果分析

目的了解铜绿假单胞菌在本院的分布及对抗生素的敏感情况,为临床治疗提供科学依据。方法回顾性调查本院2008年1月至2009年10月住院及门诊患者各种标本分离的铜绿假单胞菌的分布及对抗生素的敏感情况。结果铜绿假单胞菌在呼吸道标本的检出率最高,占63.8%,其次是伤口分泌物标本,占18.3%,尿液标本占9.2%,血液标本占2.5%;其对11种抗生素的敏感率最高是妥布霉素,其次是哌拉西林/他唑巴坦,检出多重耐药株约占35%,未出现泛耐药株。结论根据药敏结果合理使用抗生素,并重视对多重耐药株的监测工作,可有效控制感染。     

新型mucA基因突变的铜绿假单胞菌生物被膜的形成和藻酸盐相关基因表达的研究

目的 确定黏液型铜绿假单胞菌PA17的mum基因突变位点，研究藻酸盐合成相关基因在其生物被膜形成过程中的表达，并观察PAl7生物被膜形成过程和形态。方法 PCR方法扩增铜绿假单胞菌PA17的mueA基因全长并测序；改良平板培养法建立PA17的生物被膜模型，半定量RT-PCR测定生物被膜形成24h、3d．6d时藻酸盐合成相关基因,algD、algU和algR的表达，并进行统计学分析；扫描电镜观察不同时间点的生物被膜形态。结果 PA17的mucA基因第166～333位核苷酸片段缺失，第342位A→G；其藻酸盐相关基因algD和algU均在生物被膜形成过程的第6天表达水平最高，algR在24h表达最高，单因素方差分析显示，上述基因在生物被膜形成过程不同时间点表达的差异有统计学意义；PA17于第6天形成成熟生物被膜，形态为薄膜状。结论 PA17是一株含新型mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌，其藻酸盐相关基因在生物被膜形成的不同时间点的表达差异具有统计学意义，其生物被膜形态为薄膜状。     

观察铜绿假单胞菌pvdQ基因对群集游动中抗生素抗性的影响

目的 探讨铜绿假单胞菌pvdQ(PA2385)基因在群集游动中对几种常用抗生素抗性的影响.方法 构建pvdQ基因表达质粒pME6032-pvdQ并鉴定,采用电穿孔法将带有pvdQ基因的质粒转入PAO1中,构建pvdQ高表达株.同时将空质粒pME6032采用电穿孔法转入PAO1中,构建pME6032空质粒株.在不同浓度抗生素中,通过比较群集游动直径的大小,观察PAO1和pvdQ高表达株对抗生素抗性的改变.结果 经鉴定成功构建pvdQ高表达株,比较两株菌群集游动直径大小:抗生素浓度成倍增加,但群集游动直径不是成倍下降而是成不规则增加,说明PAO1和pvdQ高表达株均能提高抗生素抗性;pvdQ高表达株对头孢他啶、环丙沙星、美罗培南和多黏菌素B几种抗生素与PAO1相比抗性提高了2～4倍.结论 铜绿假单胞菌pvdQ高表达株能够提高抗生素的抗性,说明pvdQ基因在此过程中发挥重要作用,可能通过参与群集细胞的分化来提高抗生素的抗性.

Abstract：

Objective To investigate whether Pseudomonas aeruginosa pvdQ( PA2385 ) gene reveals altered antibiotic susceptibility under swarming conditions. Methods The plasmid pME6032 with pvdQ gene was constructed and identified, then transformed into Pseudomonas aeruginosa PAO1 by the electroporation, building pvdQ overexpression strain. Using the same method building pME6032-PAO1 strain.Bacteria were inoculated in LB overnight , measuring the colony diameter of the swarming zone . Results Strains of pvdQ overexpression was successfully constructed by real-time PCR. Comparison of two strains of the swarming motility of change in diameter: The result showed that PAO1 and pvdQ overexpression strains can both improve the antibiotics resistance. Swarmer cells of pvdQ overexpression strain exhibited a 2- to 4-fold increase in antibiotic resistance toward ceftazidime,ciprofloxacin, meropenem and polymyxin B compared to PAO1 on BM2-swarming agar plates. Conclusion pvdQ gene played an important role in elevating the antibiotics resistance, which through prarticipated in the swarmer cell differentiation.     

Detection of BRAF V600E mutation by pyrosequencing

INTRODUCTION: Detection of the V600E hotspot mutation in BRAF oncogene is extremely useful for the screening of hereditary non-polyposis colorectal cancer (Lynch's syndrome) and for the prediction of sensitivity to MEK inhibitors. Here we describe a method for detecting this mutation based upon pyrosequencing technology. METHODS: The efficiency of pyrosequencing for detecting BRAF V600E mutations was compared with the conventional dideoxy sequencing method in 12 tumour cell lines and in 108 colorectal tumours. RESULTS: The results from pyrosequencing were 100% concordant with those from dideoxy sequencing. This method was capable of detecting BRAF V600E mutations at a much lower ratio of mutant to wild-type alleles (1:50) than dideoxy sequencing (1:5) while being considerably faster and less expensive. CONCLUSIONS: Pyrosequencing offers a specific, sensitive, rapid and cost-effective alternative to dideoxy sequencing for the detection of BRAF V600E mutations in clinical tumour specimens.     

铜绿假单胞菌临床分离株主动外排泵的检测

目的了解铜绿假单胞菌临床分离株的耐药特点及其外排泵存在的状况。方法采用K-B法检测铜绿假单胞菌临床分离株对9种常用抗生素（庆大霉素、氨曲南、头孢他啶、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、多粘菌素B）的耐药情况;通过外排泵抑制剂氰氯苯腙（CCCP）对四种药物（羧苄青霉素、红霉素、亚胺培南、庆大霉素）的琼脂稀释法抑制试验分别检测铜绿假单胞菌的四种外排泵（MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM）的表型;应用PCR检测MexAB-OprM外排泵调节基因mexR的存在情况。结果铜绿假单胞菌对9种常用抗生素的耐药率依次为：庆大霉素36.67%（22/60）,氨曲南33.33%（20/60）,头孢他啶31.67%（19/60）,亚胺培南28.33%（17/60）,阿米卡星26.67%（16/60）,哌拉西林/他唑巴坦23.33%（14/60）,环丙沙星21.67%（13/60）,左氧氟沙星11.67%（7/60）,多粘菌素B为0。外排泵表型阳性株依次为：MexAB-OprM35株,阳性率58.33%（35/60）;MexXY-OprM13株,阳性率21.67%（13/60）;MexCD-OprJ11株,阳性率18.33%（11/60）;MexEF-OprN10株,阳性率16.67%（10/60）。35株MexAB-OprM外排泵表型阳性株中有28株扩增出mexR基因片段,检出率为80.0%（28/35）。结论铜绿假单胞菌临床分离株对庆大霉素耐药率最高,对多粘菌素B耐药率最低;MexAB-OprM外排泵的存在是铜绿假单胞菌临床分离株的重要耐药机制。     

对几种含绿脓杆菌脂多糖的物质及其抗感染保护作用的初步观察

对绿脓杆菌感染防御性抗原的研究,特别是对绿脓杆菌表面抗原的研究,一直受到研究者的重视。近些年在临床应用上也有不少进展。在美国,Alexander 等研制的绿脓杆菌表面物质7价疫苗于1968年开始试用于临床,使烧伤患者因绿脓杆菌感染的死亡率下降。英国的 Jones 等研制出绿脓杆菌表面抗原多价疫苗,1976年完成系统的实验     

利用Au蛋白芯片技术快速鉴定铜绿假单胞菌的研究

目的 利用Au蛋白芯片建立铜绿假单胞菌蛋白指纹图谱诊断模型,为铜绿假单胞菌感染快速鉴定奠定基础.方法 收集临床分离鉴定的铜绿假单胞菌64株及对照菌199株,随机分成训练组和验证组.运用表面增强激光解析电离飞行时问质谱技术及Au蛋白芯片(proteinchip golden array)检测铜绿假单胞菌及对照菌的蛋白表达,用Ciphergen Proteinchip和BioMarker Wizard软件自动采集数据,筛选铜绿假单胞菌特征性蛋白.结果 经 BioMarker Patterns 软件建立分类树模型.利用该模型对29株铜绿假单胞菌和64株对照菌进行盲法验证.结果 在相对分子质量3000～20 000范围内共检测到80个蛋白峰,其中具有统计学差异的蛋白峰58个(P＜0.01).BioMarker Patterns软件判别分析,择优选出质荷比(M/Z)为14 045.2的蛋白质峰建立铜绿假单胞菌分类树模型.验证结果表明其对铜绿假单胞菌诊断的灵敏度和特异度分别为96.55%(28/29)、100%(64/64).结论 利用Au蛋白芯片技术可快速鉴定铜绿假单胞菌.

Abstract：

Objective To establish protein fingerprinting identification model of Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and to lay a foundation for rapid identification of P. aeruginosa by proteinchip golden array. Methods Sixty-four P. aeruginosa and one hundred and ninety-nine control bacteria identified in our laboratory were collected and divided into training and testing group. Surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) and proteinchip golden array were used to detect the protein profiling of the bacteria. Data were automatically collected by Ciphergen Proteinchip Software and protein markers of P. aeruginosa were screened by BioMarker Wizard Software. Classification tree model was developed and validated by BioMarker Patterns Software. The model was blindly tested with twenty-nine P. aeruginosa and sixty-four control bacteria. Results Eighty protein peaks were detected between 3000 and 20 000, among which fifty-eight ones showed significantly difference between P. aeruginosa and the control bacteria (P＜0.01). By BioMarker Patterns Software, one protein peak ( M/Z at 14 045.2) was chosen to develop a classification tree model. The results exhibited with sensitivity of 96. 55% and specificity of 100%. Conclusion Proteinchip golden array has the potential for rapid identification of P. aeruginosa.     

Silver against Pseudomonas aeruginosa biofilms

Silver has been recognized for its antimicrobial properties for centuries. Most studies on the antibacterial efficacy of silver, with particular emphasis on wound healing, have been performed on planktonic bacteria. Our recent studies, however, strongly suggest that colonization of wounds involves bacteria in both the planktonic and biofilm modes of growth. The action of silver on mature in vitro biofilms of Pseudomonas aeruginosa, a primary pathogen of chronic infected wounds, was investigated. The results show that silver is very effective against mature biofilms of P. aeruginosa, but that the silver concentration is important. A concentration of 5-10 mug/mL silver sulfadiazine eradicated the biofilm whereas a lower concentration (1 mug/mL) had no effect. The bactericidal concentration of silver required to eradicate the bacterial biofilm was 10-100 times higher than that used to eradicate planktonic bacteria. These observations strongly indicate that the concentration of silver in currently available wound dressings is much too low for treatment of chronic biofilm wounds. It is suggested that clinicians and manufacturers of the said wound dressings consider whether they are treating wounds primarily colonized either by biofilm-forming or planktonic bacteria.