体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向γ-氨基丁酸（GABA）能神经元方向的分化。方法大鼠股骨骨髓分离出BMSCs,培养传代,通过10%胎牛血清（FBS）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）和改良Eagle培养基（DMEM/F12）预诱导24 h,随之加入含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 ng/ml骨形成蛋白-2（BMP-2）和10 ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF）作用48 h后,再以10μmol/L全反式维甲酸（ATRA）培养48 h,最后用40 mmol/L KCl刺激15 min完成诱导分化。对照组用10%FBS和DMEM/F12培养不添加任何诱导因子。形态学观察和Western blot对分化后的细胞进行鉴定分析。结果实验组细胞在形态学上表现出典型的神经元样细胞形态,对照组无明显变化;Western blot分析知实验组Ⅰ和实验组Ⅱ都有分化为GABA能神经元的趋势,但实验组Ⅱ的分化率高于实验组Ⅰ。结论BMSCs可在体外分化为GABA能神经元。     

体外诱导成人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞

目的探讨成人骨髓基质细胞(BMSCs)的生物学特性及诱导为神经元样细胞的方法.方法采用Ficoll-Paque液(1.077×103g/L)从成人骨髓中分离BMSC,体外扩增,以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(ATRA)、联丁酰基环腺苷酸(dbcAMP)为诱导剂,诱导期间观察细胞形态和数目的变化,并通过免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果此诱导条件下95%的细胞成为神经元样细胞,免疫组织化学检查显示这些细胞表达NSE、GFAP或nestin.结论bFGF和EGF、ATRA、dbcAMP能诱导成人BMSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的阳性转化率.     

诱导成人骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化的实验研究

目的　体外诱导成人骨髓基质细胞 (BMSCs)转化为神经干细胞 (NSCs)进而分化为神经元和胶质细胞。方法　以含有碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)或表皮生长因子 (EGF)加 b FGF或 b FGF、EGF加全反式维甲酸 (ATRA)的培养液培养 BMSCs,进行显微镜观察 ,纤维连接蛋白 (fibronectin)、I型胶原 (collagen )和神经上皮干细胞蛋白 (nestin)免疫组织化学染色和神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫荧光染色。结果　经诱导物诱导 72 h后 ,fibronectin和 collagen I免疫阳性细胞减少。nestin免疫阳性细胞增多。 7d后 ,其又减少。同时 NSE和 GFAP免疫阳性细胞增多。细胞分化后 ,NSE阳性细胞最多占细胞总数的 2 4 .76 %±2 .72 % ,同时 GFAP阳性细胞占细胞总数的 36 .5 8%± 3.2 6 %。结论　 EGF、b FGF、ATRA及适宜的培养液可使BMSCs定向 ,转化为 NSCs,进而分化为神经元和胶质细胞。     

骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究

目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.     

胶质细胞源性神经营养因子诱导骨髓基质细胞向多巴胺能神经元分化的观察

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在体外能否诱导骨髓基质细胞（BMSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化及可能机制。方法无菌条件下，抽取成年SD大鼠胫骨内骨髓组织，分离制备成单细胞悬液进行培养。将增殖传代至第5代的BMSCs随机分为GDNF诱导组和对照组。继续培养7d后，应用BrdU／GFAP、BrdU/NeuN和TH免疫荧光单标和双标技术检测BMSCs增殖和分化情况。结果两组BMSCs继续培养7d后，增殖仍然活跃，有部分细胞向神经元和胶质样细胞分化，呈Brdu，GFAP、BrdU/NeuN和TH阳性表达，但GDNF组的增殖力更强，向神经元和TH神经元分化的数量明显多于对照组（P〈0．05）。结论GDNF能促进BMSCs的增殖和诱导BMSCs分化成神经元和胶质样细胞，其中少部分可分化为TH神经元（即DA能神经元）。     

脂肪源性γ-氨基丁酸能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效观察

目的 研究脂肪来源的间充质干细胞诱导为γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的方法 ,探讨GABA能神经元移植治疗帕金森病模型大鼠的疗效. 方法 取大鼠脂肪组织.利用本单位自行配制的神经干细胞培养基诱导分化为神经干细胞,利用GABA能神经元定向诱导培养基对神经干细胞进行二次定向诱导,并对其进行特异性鉴定.将诱导成功的神经干细胞、GABA能神经元分别移植入帕金森病大鼠模型的丘脑底核,在移植后2周、4周、8周观察大鼠行为学变化情况.结果 体外扩增的脂肪间充质干细胞经过神经干细胞培养基培养后,细胞定向诱导并表达巢蛋白、神经元烯醇化酶(NSE)等神经干细胞标志.经GABA能神经元定向分化培养基二次诱导后,免疫荧光鉴定细胞GAD65阳性.立体定向移植细胞4周后,神经干细胞组与GABA能神经元组的大鼠行为学均得到改善,且GABA能神经元组的疗效更加显著. 结论 脂防来源的间充质干细胞可诱导分化为GABA能神经元,将其移植人大鼠的丘脑底核可以明显改善帕金森病大鼠的运动功能.     

兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的动态观察体外神经营养剂联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的效果.方法将BMSCs分离体外扩增培养后,分别加入神经营养剂金路捷、三磷酸腺苷(ATP)、神经节苷脂(GM1) bFGF诱导其分化.分别于6、24、48、72、96h后光镜下观察细胞形态变化并通过免疫组织化学测定特异性神经元稀醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果神经营养剂联合bFGF诱导6 h后出现胞体收缩,Nestin表达阳性,24 h后伸出突起,有不同程度NSE、GFAP表达,3 d后达高峰.结论神经营养剂联合bFGF能提高诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导率.     

骨髓间充质干细胞对创伤性脑损伤治疗的研究进展

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是一种存在于骨髓中的组织干细胞,具自我更新和多向分化潜能,在不同的诱导条件下可分化为多种细胞,其中包括神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。BMSCs能合成多种细胞生长因子,促进中枢神经系统的神经再生,促进损伤脑组织的生存与重塑。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经细胞在体外 对C6胶质瘤细胞的趋向性

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞的趋向性。方法首先采用梯度离心分离BMSCs,在条件培养基中添加合适诱导因子诱导BMSCs分化为神经细胞,分化后的细胞进行免疫荧光细胞化学分析后与C6胶质瘤细胞采用Transwell培养板共培养,最后对迁移的细胞做统计学分析。结果 BMSC成功诱导分化为神经细胞Nestin(24.3±5.2)%、NSE(33.6±3.8)%和NeuN(41.9±4.7)%,共培养实验显示实验组迁移细胞明显多于对照组迁移细胞(p<0.05)。结论大鼠骨髓间充质干细胞分化后的神经细胞在体外对C6胶质瘤细胞具有明显趋向性。     

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化.方法取孕16 dWistar大鼠的胚鼠全脑,进行体外培养,并对培养的神经干细胞以及诱导分化的GABA能神经元进行鉴定.结果培养24h后,出现2～4个细胞的细胞球.分化2d后,神经球贴壁后伸出细长突起,并可和周边神经球伸出的突起连接.神经球周边可见大量散在贴壁的双极或多极细胞.免疫荧光染色可见神经球均有nestin、NF200、GFAP阳性细胞.取第3代神经球行GABA能神经元定向分化.分化24h后,实验组细胞球贴壁.3d后,实验组细胞球周边有大量散在分布细胞贴壁生长,胞体圆形较大,有1～2个细长突起.免疫荧光显示,实验组周边散在的贴壁细胞多为GAD65阳性细胞.GAD65阳性细胞分化率实验组(85.97±2.78)%、对照组(18.16±2.29)%,P<0.01.结论本实验利用寡核苷酸序列特异性阻断了bHLH基因家族的调控因子之一Hes1,解除了其对bHLH的抑制,促进了神经干细胞向神经元的分化.实验还发现,阻断Hes1后大大提高了神经干细胞向GABA神经元分化的比率.     

不同冻存液对人诱导性多能干细胞冻存与复苏效果的影响

目的:探讨不同冻存液对人诱导性多能干细胞(iPSC)冻存复苏后的存活率及诱导分化的影响,筛选出简单有效的冻存与复苏方法。方法:人iPSC培养至第3代后分组冻存:①含有不同配比胎牛血清(FBS)的细胞冻存液分组:A组[80%培养基(DMEM/F12)+10%FBS+10%二甲亚砜(DMSO)];B组(70%DMEM/F12+20%FBS+10%DMSO);C组(40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO);D组(90%FBS+10%DMSO)。②含有不同配比DMSO的细胞冻存液分组:E组(45%DMEM/F12+50%FBS+5%DMSO);F组(40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO);G组(35%DMEM/F12+50%FBS+15%DMSO);H组(30%DMEM/F12+50%FBS+20%DMSO)。以相同方法冻存并复苏人iPSC,观察比较不同组细胞在复苏14 d后重新形成典型干细胞集落的数量,并在相同诱导分化体系下,记录复苏人iPSC向神经元和胶质细胞分化的效率。结果:C和F组细胞复苏后形成典型干细胞集落的数量多于其他组(P<0.05),A和B组细胞复苏后分化为神经元的效率略高于其他实验组。结论:以40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO配比组合成的细胞冻存液作为人iPSC的冻存保护剂,可使人iPSC的冻存复苏效率最优并保持较好的生物学特性。     

NPPB对星形胶质细胞增殖的抑制作用

目的观察体积调节性阴离子通道阻滞剂NPPB对体外培养星形胶质细胞增殖的影响。方法采用原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞,实验分为对照组(正常培养基培养)与NPPB干预组;在不同时间点(0、6、12、24、48h),应用流式细胞技术以及免疫细胞荧光双标法(Brdu/DAPI)检测各实验组星形胶质细胞增殖及细胞周期进展的情况。结果与对照组相比,NPPB干预组在12、24h时星形胶质细胞增殖率较正常对照组降低(P<0.05),同时处于S期细胞的百分率亦相对正常对照组明显下降(P<0.01)。结论体积调节性氯离子通道阻滞剂NPPB可以显著抑制体外培养星形胶质细胞增殖及细胞周期进展,提示VRAC通道参与了体外培养星形胶质细胞的增殖。     

NSCs在OECs诱导下定向分化及神经元电生理特性研究

目的探索大鼠嗅鞘细胞（OECs）对神经干细胞（NSCs）分化的影响,并记录分化后神经元电生理特性。方法在无血清改良Eagle培养基（DMEM／F12）培养的NSCs中,加入OECs条件培养基,观察分化情况,巢蛋白（nestin）鉴定NSCs、神经丝蛋白200（NF200）鉴定神经元、膜片钳检测神经元电生理特性。结果OECs能促进NSCs分化为神经元,分化后的神经元记录到快速激活快速失活、能被河豚毒素（TTX）特异阻断的钠电流及慢激活慢失活、能被四乙基氯化铵（TEA）特异阻断的延迟整流性钾电流。结论OECs能诱导NSCs分化,分化后的神经元具有活跃的电生理特性,具有替代凋亡、坏死神经元的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、全反式维甲酸（RA）、神经营养因子（BDNF）在体外诱导BM—SCs向神经元样细胞分化的作用。方法采用出生3周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为三组：A组,bFGF＋EGF＋RA进行诱导分化;B组,BDNF＋RA进行诱导分化;C组,RA诱导分化。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫细胞化学技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗鉴定。结果A组诱导5d后有大部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达。而B组可有部分NSE阳性细胞、C组细胞有少量NSE阳性细胞。结论bFGF＋EGF＋RA、BDNF＋RA和RA均可在诱导BMSCs向神经样元细胞分化,bFGF＋EGF＋RA组更优于和BDNF＋RA组及RA组。     

不同浓度维甲酸诱导体外培养人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞的研究

目的探讨维甲酸诱导人羊膜上皮细胞向神经样细胞分化。方法以DMEM/F12培养基培养原代人羊膜上皮细胞,并将细胞分为5组:对照组;1×10-8mol·L-1维甲酸组;1×10-7mol·L-1维甲酸组;1×10-6mol·L-1维甲酸组;1×10-5mol·L-1维甲酸组。各维甲酸组经维甲酸处理7 d后,用免疫组化检测神经干细胞巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白2(MAP-2)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和细胞全能性标记物Oct-4表达,并计数阳性细胞比例。结果与对照组比较,各维甲酸组显著提高人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞的比例,其中1×10-6mol·L-1维甲酸组阳性细胞比例最高;结论维甲酸体外能诱导人羊膜上皮细胞向神经样细胞分化,最适诱导浓度为1×10-6mol·L-1。     

还原型谷胱甘肽诱导大鼠骨髓基质细胞GFAPmRNA及蛋白表达变化

目的：研究还原型谷胱甘肽（GSH）对大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）胶质纤维酸性蛋白（GFAP）mRNA及蛋白表达的影响。方法：传3代骨髓基质细胞随机分为GSH诱导组和对照组。GSH诱导组加入10mmol·L^-1GSH20μL,对照组加入生理盐水20UL,两组使用的培养基和处理过程相同。于加入GSH和生理盐水后6、12和24h观察记录细胞的生存情况及细胞的形态变化。采用实时荧光定量PCR和Westernblot法检测各组诱导后细胞GFAPmRNA及蛋白表达水平的变化。结果：经GSH诱导后BMSCs形态发生明显改变,GSH诱导组GFAPmRNA及蛋白表达水平显著高于对照组（P〈0．05）,以诱导12h后变化最为明显。结论：BMSCs经GSH诱导后GFAPmRNA及蛋白表达量显著增多。     

Adult cerebrospinal fluid does not support neurogenesis from fetal rat neural stem cells

The purpose was to study the effect of human cerebrospinal fluid (CSF) on differentiation of rat neural stem cells (NSCs), and thus explore the feasibility of transplanting stem cells via lumbar puncture clinically. Rat NSCs derived from fetal brain were divided into two groups, and cultured in DMEM/F12 supplemented with 10 % FBS and human CSF, respectively. Cellular growth was observed with an inverted microscope, and immunostaining was used to analyze differentiation of NSCs in both groups. Cells of fetal brain showed shapes of spindle or star with minor sprouts at fifth day post-culture, and stained with nestin. NSCs in the control group differentiated into neurons, with positive staining to NSE, when cultured further in DMEM/F12 supplemented with 10 % FBS. While NSCs in the experiment group, cultured in CSF, differentiated into astroglia on eighth day, with positive immunostaining to GFAP. The new neurons dissolved rapidly when they were cultured in CSF. Human CSF cannot promote NSCs to differentiation toward neuron, nor support newborn neurons survival. It seems an inappropriate approach to transplant stem cells through CSF.     

红景天苷和脑源性神经营养因子与神经干细胞共移植对致鼠神经干细胞定向分化的研究

目的：探讨红景天苷和脑源性神经营养因子（BDNF）、神经干细胞（NSCs）共移植对致鼠NSCs定向分化影响。方法：将戊四氮致大鼠分为模型组、NSCs组、NSCs＋BDNF组和NSCs＋BDNF＋红景天苷组。取新生大鼠海马组织,将培养的NSCs与BDNF＋红景天苷＋BDNF和基础培养基分别移植至致鼠海马组织中,苏木精-伊红染色及免疫组化检测不同时间点5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、谷氨酸脱羧酶（GAD65）阳性细胞数,并观察大鼠行为学改变。结果：NSCs＋BDNF＋红景天苷共移植组与其他组比较,各时间点BrdU、GAD65阳性细胞数均增多（P〈0.05）。第3周开始,大鼠癫发作次数最少（P〈0.05）。结论：BDNF与红景天苷联合有利于神经干细胞向γ-氨基丁酸能神经元分化。两者联合移植至致鼠后能减少大鼠的癫发作次数。     

高渗刺激引起培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞和C6细胞合成并释放谷氨酸

目的观察高渗刺激对培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞或C6细胞合成、释放谷氨酸的影响。方法获取一日龄SD大鼠下丘脑组织，进行星形胶质细胞培养、纯化和鉴定。培养细胞随机分五组：（1）等渗组：用新鲜等渗培养液置换原先的培养液，将细胞分成5个亚组，分别孵育1、3、5、10和15min。（2）高渗组：用320mosMNaCl高渗溶液置换原先的培养液，将细胞分成5个亚组，分别孵育1、3、5、10和15min。（3）甘伯酸（carbenoxolone，CBX，一种缝隙连接阻断剂）＋等渗组和（4）CBX＋高渗组：用含有CBX（终浓度为100mmol／L）的等渗培养液作用1h，后分别用等渗或高渗培养液置换出原培养液，将细胞分成5个亚组，分别孵育1、3、5、10和15min。（5）Ca2＋高渗组：用含有Ca2＋（1000μmol／L）的等渗培养液作用1h，后用高渗培养液置换出原培养液，将细胞分成5个亚组，分别孵育1、3、5、10和15min。每个亚组5个培养皿。收集各组的细胞，进行抗谷氨酸和抗胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）的双重免疫荧光染色，Confocal显微镜观察。用反相高效液相色谱荧光测定法测定细胞培养液中谷氨酸的含量。培养的C6细胞分为四组：等渗组，高渗组，CBX＋等渗组和CBX＋高渗组，用于流式细胞仪（flowcytometry，FCM）定量检测细胞内谷氨酸的含量。结果星形胶质细胞内抗GFAP染色的荧光强度在五组问无明显差异。星形胶质细胞内抗谷氨酸染色的荧光强度在等渗组中各时间点无明显变化，高渗组中在刺激1min后表达增加，5min达到高峰，15min恢复到正常。CBX＋高渗组的抗谷氨酸染色荧光强度明显高于CBX＋等渗组和等渗组，一直维持到15min不下降。培养基中的谷氨酸浓度在等渗组各时间点无明显变化，高渗组中谷氨酸浓度从5min到15min明显增加。Ca2＋高渗组和CBX＋高渗组中?