新型套式原位PCR-ISH法检测肝组织HCV RNA

丙型肝炎病毒 ( HCV)是引起慢性肝炎的主要原因 ,在发展成肝硬化的病人中 ,导致2 0 %～ 2 5%的病人死亡。由于 HCV表达量非常低 ,因此检测肝脏中的病毒 RNA有困难。为了检测和定位用福马林固定的、石蜡包埋的肝组织中的病毒 RNA,发展了原位聚合酶链反应 ( PCR) -原位杂交 ( PCR- ISH)法。　　通过使用来自病毒基因组 5′端的引物 ,采用原位套式 PCR技术检测了 1 7份已知HCV感染病人的肝组织切块 ,运用液相反转录 PCR( RT- PCR)方法从其中 1 1例病人肝中检出病毒 RNA。在这些阳性标本中 ,通过原位 PCR- ISH法检出 1 0份阳…     

核糖核酸Ⅱ制备及其病毒灭活工艺的验证

目的从牛胰脏制备核糖核酸Ⅱ(RNAⅡ),对巴氏灭活法灭活病毒工艺进行验证。方法以苯酚、氯仿抽提法制备,以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用巴氏灭活法(60℃,10h)灭活RNAⅡ原液中病毒的效果,用纯度、A260/A280比值、紫外特征峰、完整性、含量变化考察灭活前后制剂变化。结果制备了纯度和活性均较好的RNAⅡ,PPV滴度为7.7logTCID50/0.1mL时灭活液中未检测出PPV,经盲传3代,亦未发现特异性细胞病变,灭活前后制剂无质的变化。结论可以现行方法从牛胰脏制备较高纯度RNAⅡ,巴氏法能对RNAⅡ溶液作有效的病毒灭活处理。     

直接检测HIV-1感染的方法

已经证实,检测1型人类免疫缺陷症病毒(HIV-1)抗体是诊断HIV-1感染高度敏感和特异的方法.然而,对某些特殊的临床情况,血清学方法有其局限性.为解决这些问题,已建立了多种检测传染性病毒或病毒结构成份的替代的诊断试验.所有HIV-1大分子成份(DNA、RNA和蛋白)均作为病毒存在的标志.本文综述了这些直接方法的使用,并试图确定各种直接试验在诊断方法中可能的作用.     

影响巢式RT-PCR反应效果的因素分析

目的 :探讨癌基因研究中影响巢式反转录聚合酶链式反应 (巢式 RT- PCR)扩增效果的因素。方法 :以巢式RT- PCR法检测 5 5例大肠癌患者门静脉血和 5 4例卵巢癌患者及 10例妇科良性肿瘤患者骨髓中细胞角化蛋白基因 - 19(CK- 19) m RNA的表达 ,并对实验方法进行了改良和优化。结果 :大肠癌中有 5 4.5 %检得 CK- 19阳性 ,卵巢癌中有 6 3.0 %检得 CK- 19阳性 ,10例妇科良性肿瘤无 CK- 19表达。结论 :经过上述三方面措施改良后的巢式 RT- PCR能够用来检测恶性肿瘤患者 CK- 19m RNA的表达 ,因而成为监测这类肿瘤患者造血及血液循环系中癌细胞分布情况的一种有效的分子生物学手段     

聚合酶链反应增强的免疫测定法在抗肠道病毒IgM诊断方面的应用

聚合酶链反应 (PCR)增强的免疫测定法(PIA)是将固相血清学技术与 PCR结合 ,提供了一种多功能且敏感的抗体检测方法。作者将 PIA技术运用于抗肠道病毒 Ig M抗体的检测 ,即 Ig M抗体先被捕获于抗人 Ig M包被的微孔板中 ,抗肠道病毒 Ig M能结合肠道病毒粗抗原 ,被结合的病毒经加热变性 ,释放出的 RNA用作逆转录 PCR(RT- PCR)的模板 ,扩增产物与亲和标记的探针杂交后用微孔比色法检测。　　预初试验中 ,作者检测了 1 8份肠道病毒感染病人的血清样本。PIA所用的病毒抗原为柯萨奇病毒和埃可病毒共 1 0个亚型参考株的混合物。为了检…     

肠道小RNA病毒在151例脑膜炎患者脑脊液中的检测分析

目的：分析脑脊液中肠道小RNA病毒的检测结果,了解所检测的RNA病毒在脑膜炎中的致病作用。方法：检测脑脊液标本肠道小RNA病毒用聚合酶链反应方法（PCR）。结果：肠道小RNA病毒的阳性率分别为：小RNA病毒31.3%(47/151)、B组柯萨奇病毒（COXB）30.5%(46/151）。37例对照组的脑脊液中,未检出肠道小RNA病毒。结论：肠道小RNA病毒和COXB是导致脑膜炎的重要病原体。PCR方法可以用于脑膜炎的临床病因学诊断。     

短波紫外线对人凝血因子Ⅷ中猪细小病毒灭活的研究

目的 研究短波紫外线(short-wave ultraviolet-C,UV-C)对人凝血因子Ⅷ(human coagulationfactor Ⅷ,FⅧ)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活的效果.方法 将PPV作为指示病毒与FⅧ中间品混合,用紫外灭活仪UVivatec分别以200、300和400 J/m2 UV-C进行灭活.将UV-C灭活的FⅧ接种ST细胞并进行培养,采用细胞病变(cytopathic effect,CPE)法检测病毒,并以Reed-Muench法计算病毒滴度.对所有UV-C灭活后未出现CPE的样品盲传3代,验证灭活效果;同时对UV-C灭活前后的FⅧ活性进行检测.结果 3个照射剂量的UV-C灭活后,FⅧ中的PPV滴度降低均不低于每0.1 ml4.62lg半数组织培养感染剂量,所有未出现CPE的样品盲传至第3代均未检到病毒.UV-C灭活的FⅧ的活性无明显降低,且各项质量指标均符合药典的要求.结论 UV-C可有效灭活无包膜病毒PPV,且对FⅧ活性无明显影响.     

亚甲蓝光化学疗法病毒灭活新鲜冰冻血浆在广州增城地区的临床应用可行性

目的通过检测新鲜冰冻血浆病毒灭活前后Ⅷ因子含量及病毒灭活效果的变化,探讨病毒灭活新鲜冰冻血浆在增城地区临床应用的可行性。方法将300袋未灭活新鲜冰冻血浆作为对照组,进行Ⅷ因子含量检测;将病毒灭活后上述300袋新鲜冰冻血浆作为实验组,进行Ⅷ因子含量检测,计算病毒灭活后Ⅷ因子含量。将5袋确诊HBV和5袋确诊HCV的新鲜冰冻血浆采用荧光定量PCR检测方法检测亚甲蓝光化学疗法病毒灭活前后,病毒灭活效果的变化。临床随机抽取200例输注病毒灭活血浆的患者,观察病毒灭活血浆输注后是否出现输血不良反应。结果新鲜血浆病毒灭活前后血浆Ⅷ因子含量为(1.097±0.047)IU/m L(0.824±0.027)IU/m L;凝、血因子Ⅷ含量灭活前后差异有统计学意义(P0.01);利用亚甲蓝光化学疗法血浆病毒灭活技术对凝血因子Ⅷ含量有一定的影响,但是均达到GB 18469-2012《全血及成分血质量要求》对病毒灭活新鲜冰冻血浆的质量要求。标本病毒灭活后血浆HBV-DNA及HCV-RNA载量均为1000copies/m L。病毒灭活血浆输注人体后无不良反应发生。结论临床使用较安全,病毒灭活新鲜冰冻血浆能够有效降低经输血传播疾病的危险性,且不良反应较小。在广州增城地区的临床应用是可行的。     

对瘟病毒属污染疫苗、干扰素和细胞基质的评价

为了更好了解瘟病毒属污染生物制品的可能性 ,作者应用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)对美国生产和 /或许可的 38批疫苗和5批α干扰素 (IFN-α)中是否存在牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)基因组进行了测定。此外 ,还对常用于生产生物制品的 5个细胞系或细胞是否会感染 BVDV进行了评价。　　作者用 EMEM培养基或麻疹 /脊髓灰质炎疫苗按 1 0倍 (1 0 - 1 ～ 1 0 - 7)系列稀释BVDV NADL 株来测定 BVDV RT- PCR的敏感度。结果显示 ,RT- PCR能检出 0 .0 4个传染性颗粒 /μl,加入麻疹和脊髓灰质炎疫苗并不影响 RT- PCR的敏感性 ,说明疫苗…     

恒温水浴工艺步骤灭活小牛血去蛋白提取物病毒效果的验证研究

目的:验证小牛血去蛋白提取物中间品生产工艺中60℃水浴7小时对产品所携带病毒的灭活效果,确定小牛血去蛋白提取物生产中病毒灭活措施的有效性.方法:选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),以及不同核酸类型的非脂包膜病毒,其中RNA病毒为呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo...     

生物制品安全性国际讨论会——疫苗的病毒污染问题

本文讨论了病毒疫苗污染的原因及解决污染问题的途径。病毒灭活要根据不同的产品和污染病毒的量分别采用热灭活、γ射线和紫外线及化学灭活剂等方法。作者还讨论了细胞培养系统和实验室工作人员由血清和实验动物引起的病毒污染问题。阐述了PCR在诊断病毒污染方面的应用,提出血清学和分子学方法结合是目前诊断病毒污染最有效的方法。     

膀胱肿瘤多药耐药基因的表达及其临床意义

目的　探讨膀胱肿瘤多药耐药基因 (MDR- 1m RNA)的表达与临床化疗的相关性。方法　采用逆转录多聚酶链反应 (RT- PCR)技术 ,对 2 6例正常膀胱粘膜和 30例膀胱肿瘤 MDR- 1m RNA的表达进行了检测。结果　 2 6例正常膀胱粘膜中 MDR- 1m RNA表达为 15 .4% ,16例初发膀胱癌 MDR- 1m RNA有表达为37.5 % ,14例复发膀胱癌的 MDR- 1m RNA表达为 78.6 % ,并对其进行了临床生物学行为的观察和比较。结论　多药耐药现象在正常膀胱粘膜中有表达 ,在部分初发膀胱癌中有先天性存在 ,RT- PCR方法检测膀胱肿瘤时具有相对敏感、特异、方便、快速和结果可靠等优点     

亚甲蓝光化学疗法血浆病毒灭活技术的应用分析

目的根据2012年颁发的GB18469—2012《全血及成分血质量要求》中对病毒灭活新鲜冰冻血浆质量控制项目和要求,分析亚甲蓝光化学疗法血浆病毒灭活技术在血浆灭活过程中对血液成分和功能的影响,探讨亚甲蓝光化学疗法血浆病毒灭活技术的疗效及安全性,为进一步广泛推广应用提供临床参考依据。方法采用称重法、双缩脲法、磁珠法、比色法、荧光定量PCR检测方法检测亚甲蓝光化学疗法病毒灭活前后的血浆量、血浆蛋白含量、凝血因子Ⅷ含量、亚甲蓝残留量、病毒灭活效果的变化。结果新鲜血浆病毒灭活前后血浆容量分别为（235±15．51）g、（230±14．17）g;Ⅷ因子含量为（1．084±0．045）IU／ml、（0．826±0．029）IU／mk血浆蛋白含量为（83．71±3．24）g／L、（79．09±3．21）g/L;凝血因子Ⅷ含量灭活前后差异有统计学意义（P〈0．01）;血浆容量和血浆蛋白在灭活前后无统计学意义（P〉0．05）,亚甲蓝的残留率为（0．0638±0．013）μmol／L;标本病毒灭活后血浆HBV—DNA及HCV—RNA载量均为〈1000copies／ml。结论利用亚甲蓝光化学疗法血浆病毒灭活技术对血浆成分有一定的影响,但均达到GB18469—2012《全血及成分血质量要求》对病毒灭活新鲜冰冻血浆的质量要求。亚甲蓝光化学疗法简便、无毒、能最大程度的减少新鲜冰冻血浆病毒等显著特点,可有效消除临床输血带来的安全隐患。     

外膜蛋白对59株大肠埃希菌耐药性的影响

目的:研究外膜蛋白对59株耐头孢西丁大肠埃希菌耐药性的作用。方法:用聚合酶链反应(PCR)方法检测外膜蛋白OmpF基因;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测外膜蛋白;微量稀释法测定20种抗菌药物对试验菌株的敏感性。结果:59株大肠埃希菌中,29株OmpF基因阳性(49%),其中在产AmpC酶25株中有20株OmpF基因阳性;OmpF基因缺失的30株大肠埃希菌均未出现OmpF蛋白条带,其中13株同时缺失OmpC蛋白条带,29株OmpF基因阳性菌中有4株缺失OmpF蛋白条带;这59株菌对多种抗菌药物耐药。结论:OmpF基因及蛋白的缺失是非产AmpC酶菌对头孢西丁耐药的主要原因;孔蛋白缺失主要产生头孢西丁耐药,而对试验中的其它抗菌药物影响较小。     

2019-nCoV灭活方式对酶免疫法检测急性淋巴细胞白血病患儿血清甲氨蝶呤浓度的影响

目的 研究紫外线和加热2种2019-nCoV灭活方法对酶免疫法检测甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)浓度的影响，探讨该方法在疫情防控期间的应用。方法 将临床送检采血管以75%乙醇表面消毒，低速离心后，将血清分为未灭活组、紫外线灭活组和加热灭活组。其中紫外线灭活组将MTX质控液及血清样本于二级生物安全柜密闭后，紫外灯照射30 min灭活；加热灭活组将质控液与血清样本置于密封袋中，于56℃恒温水槽中水浴30 min灭活。结果 紫外线灭活组和加热灭活组MTX检测结果与未灭活组相比，差异均无统计学意义。未灭活组、紫外线灭活组和加热灭活组3组91%~95.5%的浓度点分布在Bland-Altman图中的95%一致性区间内。未灭活组、紫外线灭活组和加热灭活组3组相关系数均>0.98(P<0.001)，表明3组结果一致性良好。结论 以紫外线照射30 min或56℃加热灭活30 min处理对酶免疫法检测MTX浓度检测无影响，可用于疫情防控期间急性淋巴细胞白血病患儿MTX酶免疫法治疗药物监测的开展。     

人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定

目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体。方法针对ERRαmRNA设计了4条si RNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelp-er1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果。结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml。转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低。结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础。     

锰致大鼠多巴胺能神经细胞DA分泌减少效应中PARK2基因的调控作用

目的研究锰对经RNA沉默PARK2基因后的多巴胺(DA)能神经元细胞功能的影响。方法用原代培养新生大鼠纹状体细胞,分3类处理组,即:单纯锰处理组、慢病毒对照组和慢病毒PARK2 SiRNA干扰处理组。各处理组均用不同浓度锰(0、300和500μmol/L)处理,分别用q PCR检测PARK2表达,Western blot检测Parkin,ELISA法检测细胞分泌的DA水平。结果在各处理组中:与0μmol/L相比较300和500μmol/L染锰组PARK2表达及Parkin蛋白、DA分泌含量均下降,差异有统计学意义(P0.05);单纯染锰处理组及慢病毒对照组与PARK2 SiRNA干扰处理组比较,相同染锰剂量的PARK2表达及Parkin蛋白、DA分泌含量均降低,差异有统计学意义(P0.05);单纯染锰处理组与慢病毒对照组比较,相同染锰剂量的PARK2表达及Parkin蛋白、DA分泌含量均无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。结论对大鼠多巴胺(DA)能神经元细胞进行PARK2RNA干扰后再染锰,可加重其DA分泌量的降低,锰暴露作用下DA能神经元的功能与PARK2的改变相关。     

乙型肝炎外膜大蛋白血清学检验及临床意义

目的:探讨乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)检测的临床意义。方法:收取223例慢性乙型肝炎患者血清,用荧光聚合酶链反应(PCR)定量法检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBVDNA,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测HBV-LP,前S1抗原(Pre-S1Ag),用时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎病毒血清标志物。结果:HBVDNA与HBV-LP阳性率比较差异有显著性(P<0.001)。HBV-LP与Pre-S1Ag阳性率比较差异有显著性(P<0.001)。HBeAg与HBVDNA,HBV-LP及Pre-S1Ag阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:血清HBV-LP检测是对病毒复制检测的补充。     

RNA干扰沉默DDX1基因的胶质瘤细胞系的建立

目的以短发夹核糖核酸(RNA)慢病毒载体建立DEAD-box解旋酶1(DDX1)基因稳定沉默的胶质母细胞瘤细胞株。方法针对DDX1基因设计2组短发夹RNA序列,退火形成的双链DNA与线性p LKO. 1-puro-e GFP质粒载体连接,构建慢病毒质粒载体,测序正确后进行慢病毒包装;将获得的重组慢病毒转染人胶质瘤U251细胞,转染细胞分为对照组和干扰组,对照组转染对照慢病毒(sh NC);干扰组转染慢病毒载体p LKO. 1-puro-e GFP-shRNA-DDX1(sh DDX1-1,sh DDX1-2)。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,进行嘌呤霉素抗性筛选;用实时定量聚合酶链式反应(PCR)、蛋白免疫印迹法检测转染后U251细胞中DDX1 mRNA及蛋白表达。结果测序证实成功构建对照组和靶向DDX1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,病毒悬液滴度均> 3×10~8TU·m L^-1。荧光显微镜下观察显示,对照组和干扰组转染效率高于85%;嘌呤霉素筛选后,干扰组sh DDX1-1、sh DDX1-2中DDX1 mRNA的抑制率分别为85. 44%和71. 66%,DDX1蛋白表达水平分别下降了99. 1%和96. 7%,均较对照组(100%)显著降低(均P <0. 01)。结论成功构建沉默DDX 1基因的胶质瘤细胞系,为研究DDX1对胶质瘤生物学行为的影响提供细胞模型。     

用狗评价4型和7型腺病毒重组乙型肝炎疫苗

用4型腺病毒Ad4(CL68578)和7型腺病毒Ad7(55142)疫苗株作载体,将HBaAg插入其E3区组建成两个重组病毒Wy-Ad7HZ6-1和Wy-Ad4 HH×HS。它们在A549人肺癌细胞上的复制情况与同种亲本疫苗株相仿。选择健康的6月龄猎兔犬,经咽、气管内或肠道接种具有传染性或经紫外线灭活的病毒(对照组),观察狗的血清学应答,Ad病毒滴度,抗-HBs特异性和亲和力。