局灶性脑缺血大鼠永生化神经前体细胞移植的可行性

目的：观察局灶性脑缺血大鼠移植永生化神经前体细胞在脑内的存活情况，为进一步研究细胞移植及转基因治疗脑缺血提供有意义的数据及图像资料。方法：实验于2005—10／2006—03在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室进行。①选取健康雄性SD大鼠18只，随机数字表法分为假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组，6只／组。②脑缺血对照组、细胞移植组采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血模型。假手术组仅分离血管，不进行脑缺血处理。③应用无血清Neurobasal培养基进行INPC培养，移植前加入BrdU，使终浓度为10μmol／L，标记3d，然后取出细胞爬片。无水甲醇固定10min，SP法检测BrdU标记细胞阳性率。④将BrdU标记3d的永生化神经前体细胞用胰蛋白酶消化，离心重悬后使细胞密度达到2&;#215;10^10L^-1，细胞移植组于大鼠脑缺血后3d取5μL永生化神经前体细胞移植到右侧纹状体缺血半暗带区，以前囟为零点，即A：-0．5mm。R：2．5mm，V：-4．5mm。脑缺血对照组仅注射等量磷酸盐缓冲液。⑤各组分别于缺血后6h，1d，3d及细胞移植后1周对大鼠进行Longa神经功能评价（0-4分，分数越高表示神经功能损伤越严重），缺血后6h神经功能评分≥1分视为模型成功。⑥细胞移植后1周处死各组大鼠，取脑组织制作冰冻切片，通过免疫组织化学SP法检测BrdU的表达，观察移植的永生化神经前体细胞在脑内缺血半暗带区的存活情况。结果：18只大鼠均进入结果分析。①体外检测移植细胞BrdU标记阳性率：永生化神经前体细胞加入BrdU标记3d后，免疫组化检测阳性细胞胞核呈棕黄色，细胞阳性率达95％以上。②造模后不同时间点各组大鼠神经功能评价：缺血后6h，脑缺血对照组与细胞移植组每只大鼠神经功能Longa评分均≥1分，表明造模成功，且Longa评分均明显高于假手术组[（1．70&;#177;48）分，（1．60&;#177;052）分，0分，P〈0．05]。缺血后6h，1d，3d及细胞移植后1周脑缺血对照组与细胞移植组Longa评分均基本相似（P〉0．05）。③移植细胞的存活情况：细胞移植后1周，细胞移植组在永生化神经前体细胞移植侧针道附近可检测到BrdU免疫染色阳性细胞，而假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组的移植对侧BrdU免疫染色均呈阴性。结论：永生化神经前体细胞植入局灶性脑缺血大鼠缺血半暗带区后，主要存活于移植侧针道附近。     

神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血：移植部位与移植时间的比较

目的：观察大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内的迁移和分化。 方法：实验于2003-05／2004-12在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成。孕龄8～10d Wistar大鼠仔鼠神经干细胞体外扩增后，用免疫组织化学的方法分别检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志蛋白巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达，健康Wistar大鼠40只大脑中动脉闭塞后随机分成梗塞后24h脑室内移植神经干细胞组、闭塞后24h梗死中心移植神经干细胞组、闭塞后4周脑室内移植神经干细胞组、闭塞后4周梗死中心移植神经干细胞组，各实验组均有仅移植生理盐水的空白对照。比较不同移植部位和不同移植时间神经干细胞存活、增殖和迁移的差异。结果：实验大鼠40只均进人结果分析。从胎鼠中成功培养出悬浮生长的可表达巢蛋白的神经球，含血清条件下可分化为表达胶质纤维酸性蛋白的胶质细胞和神经元特异性烯醇化酶的神经元，移植后可见移植细胞存活至少8周以上，①闭塞后24h脑室内移植神经干细胞组可见移植细胞大量存活，穿过室管膜向脑组织迁移，特别是向缺血周边区迁移；②闭塞后24h梗死中心移植神经干细胞组细胞主要聚集在梗死中心移植区域，也有大量细胞存活。充填梗死区。少量细胞可穿过胼胝体向健侧迁移；③闭塞后4周脑室内移植神经干细胞组仅见少量Brdu阳性细胞存活，但细胞增殖分裂较闭塞后24h脑室内移植神经干细胞组不明显，且存活细胞主要仍在移植部位；④闭塞后4周梗死中心移植神经干细胞组存活移植细胞也较闭塞后24h梗死中心移植神经干细胞组明显减少。 结论：大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内可长期存活并广泛迁移，不同移植部位不影响细胞存活，脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移，缺血后24h移植较缺血后4周移植其迁移趋向性更强。     

神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血:移植部位与移植时间的比较

目的:观察大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内的迁移和分化。方法:实验于2003-05/2004-12在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成。孕龄8～10dWistar大鼠仔鼠神经干细胞体外扩增后,用免疫组织化学的方法分别检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志蛋白巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达,健康Wistar大鼠40只大脑中动脉闭塞后随机分成梗塞后24h脑室内移植神经干细胞组、闭塞后24h梗死中心移植神经干细胞组、闭塞后4周脑室内移植神经干细胞组、闭塞后4周梗死中心移植神经干细胞组,各实验组均有仅移植生理盐水的空白对照。比较不同移植部位和不同移植时间神经干细胞存活、增殖和迁移的差异。结果:实验大鼠40只均进入结果分析。从胎鼠中成功培养出悬浮生长的可表达巢蛋白的神经球,含血清条件下可分化为表达胶质纤维酸性蛋白的胶质细胞和神经元特异性烯醇化酶的神经元,移植后可见移植细胞存活至少8周以上,①闭塞后24h脑室内移植神经干细胞组可见移植细胞大量存活,穿过室管膜向脑组织迁移,特别是向缺血周边区迁移;②闭塞后24h梗死中心移植神经干细胞组细胞主要聚集在梗死中心移植区域,也有大量细胞存活,充填梗死区,少量细胞可穿过胼胝体向健侧迁移;③闭塞后4周脑室内移植神经干细胞组仅见少量Brdu阳性细胞存活,但细胞增殖分裂较闭塞后24h脑室内移植神经干细胞组不明显,且存活细胞主要仍在移植部位;④闭塞后4周梗死中心移植神经干细胞组存活移植细胞也较闭塞后24h梗死中心移植神经干细胞组明显减少。结论:大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠脑室内可长期存活并广泛迁移,不同移植部位不影响细胞存活,脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移,缺血后24h移植较缺血后4周移植其迁移趋向性更强。     

Xbp-1基因重组神经干细胞移植对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤的影响

背景: 将转染Xbp-1基因的神经干细胞移植至脑损伤病变部位,不但确保了Xbp-1基因的稳定及持续表达发挥抗凋亡的作用,也可促进移植后神经干细胞的存活与分化能力.目的: 验证Xbp-1基因对移植大鼠脑缺血损伤处神经干细胞的分布、分化、抗凋亡作用及神经功能恢复的影响.方法: 选取成年SD大鼠采用线栓法建立大脑中动脉阻塞模型,并随机分成4组干预:对照组(不作处理)、PBS移植组、神经干细胞移植组、Xbp-1-神经干细胞移植组.于干预后7,14,28 d进行NSS评分,并取脑制各组织切片,免疫荧光染色观察神经干细胞在脑内的存活与分布情况.移植后第28天使用TUNEL染色检测缺血区域神经细胞凋亡情况,Western blot检测Bcl-2表达水平.结果与结论: 移植后7,14,28d Xbp-1-神经干细胞移植组NSS评分显著低于其他3组(P<0.05);神经干细胞可以成功迁徙到脑缺血区域并成活、分化为成熟神经细胞,Xbp-1基因修饰后的神经干细胞成活、增殖以及分化能力均强于普通神经干细胞(P<0.05);与其他3组比较,Xbp-1-神经干细胞移植组脑缺血区域神经细胞凋亡数量明显减少,Bcl-2水平升高(P<0.05).证实了Xbp-1基因修饰可以增加神经干细胞存活、迁徙能力,并通过抗内质网应激显著降低移植后大鼠缺血模型的NSS评分,促进其神经功能恢复.     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景：脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。目的：观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。方法：体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组：正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注模型,又分为缺血2h再灌注7,14,21,28d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。结果与结论：免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2h再灌注7,14,21,28d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义（P〈0.05～0.01）。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景:脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。目的:观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。方法:体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组:正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注模型,又分为缺血2h再灌注7,14,21,28d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。结果与结论:免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2h再灌注7,14,21,28d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义(P<0.05～0.01)。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤

背景：近年来,神经干细胞移植已成为治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的研究热点。目的：探讨神经干细的定向分化调控机制和神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤的研究进展。方法：以＂neural stem cells,stem cell transplantation,ischemic brain injury＂为检索词,检索Pubmed数据库1990至2012年相关文献;以＂神经干细胞,干细胞移植,缺血性脑损伤＂为检索词,检索CNKI数据库2005至2012年相关文献。分析神经干细的定向分化调控机制和神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤的内容,排除重复研究。结果与结论：①体外分离培养的神经干细胞有胚胎来源、脐血来源和成体来源,主要采用机械分离法和胰酶消化法进行分离。②目前体外培养的神经干细胞分离鉴定的标记物有巢蛋白、波形蛋白1、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、神经元特异性烯醇化酶等。③神经干细胞的分化调节是通过正负双重作用实现的,负性调节是通过对称性的分裂来增加神经干细胞数量,包括Notch信号途径和一些生长因子等。正性调节诱导神经干细胞分化,包括参与细胞合成的骨形态发生蛋白信号途径等。④神经干细胞移植的时间窗选择在实验动物脑缺血两三周后,时间过早和过晚均不适合细胞的存活。神经干细胞通过脑立体定位仪直接进行脑内移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤,移植后可见细胞在局灶性脑缺血大鼠脑室内和梗死中心均可长期存活,并可广泛迁移,移植神经干细胞后观察到其运动行为学评分有明显提高。缺血性脑卒中的神经干细胞移植治疗还存在一些问题需要解决,未来的临床应用前景广阔,是缺血性脑卒中患者的新希望。     

局灶性脑缺血对内源性神经干及前体细胞增殖、分化和迁移的影响

背景：正常成年动物中枢神经系统内存在能增殖、多向分化潜能的神经干细胞或神经前体细胞。在生理情况下，这些内源性神经干细胞或前体细胞处于静息状态。当脑缺血时，这些细胞将处于何种状态?目的：研究大鼠局灶性脑缺血时，内源性神经干细胞的分布、增殖、分化。设计：以大鼠为研究对象，随机对照的探索性研究。单位：一所医学院的神经生物学研究室、组织胚胎学教研室。材料：实验于2001—07／2002-07在泸州医学院神经生物学研究室完成。选择健康成年SD大鼠41只，雌雄不限，体质量250-300g。干预：阻塞大鼠大脑中动脉2h再灌流0．5，3，6，12h，1，2，3，5，10d制成局灶性脑缺血模型，阻塞线不能阻塞大脑中动脉为假手术组，正常大鼠为对照组。在各时间点处死动物，制成脑组织切片，用免疫组织化学单标和双标观察内源性神经干细胞或前体细胞的增殖、分布、分化。主要观察指标：内源性神经干／前体细胞的分布、分化。结果：在正常组和假手术组多数脑室室管膜细胞增殖性细胞核抗原免疫反应阳性，脑实质内有零星散在增殖性细胞核抗原阳性细胞。再灌流3h，增殖性细胞核抗原阳性细胞出现在嘴侧脑室下层。再灌流12h以后，双侧侧脑室的一些脉络膜丛细胞增殖性细胞核抗原免疫反应阳性。再灌流3-10d，视前区梗死区周边、纹状体、额顶皮质的增殖性细胞核抗原免疫反应阳性细胞显增加。再灌流3d，增殖性细胞核抗原阳性细胞开始出现于海马齿状回的颗粒下层，并随再灌流时间延长，增殖性细胞核抗原阳性细胞数量增多。免疫组化双标显示再灌流3d视前区有很少量的增殖性细胞核抗原／胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞，随后增多。再灌流10d内，未检查到增殖性细胞核抗原／神经丝双标阳性细胞。结论：脑缺血时诱导内源性神经干细胞增殖、分化，并向缺血纹状体和皮质迁移，此现象有助于阐明神经功能康复的机制。     

经颈动脉移植骨髓间充质干细胞治疗局灶性大鼠脑缺血损伤

目的:经颈动脉移植骨髓间充质干细胞至大脑中动脉闭塞大鼠体内,观察移植后大鼠缺血性脑损伤神经功能的恢复作用。方法:实验于2006-04/11在天津医科大学环湖医院实验室进行。实验材料:健康成年SD大鼠,体质量250～300g,雄性,由中国军事医学科学院动物中心(北京)提供(SCXK-(军)2002-001)。实验方法:①骨髓间充质干细胞分离、原代培养及诱导:采用梯度密度离心法和贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞生长达80%～90%融合时开始进行诱导分化,诱导液为DMEM培养基 2%二甲基亚砜 200μmol/L3-叔丁基-4羟基茴香醚 5mmol/Lβ-巯基乙醇。倒置相差显微镜观察骨髓间充质干细胞形态学变化。②动物模型建立及颈动脉骨髓间充质干细胞移植:采用改良Longa's线栓法阻断SD大鼠左侧大脑中动脉,制成局灶性脑缺血模型。模型建立成功判定:大鼠清醒后,观察其体征,以右侧肢体瘫痪,前肢为重表明模型制作成功。模型建立成功后24h,骨髓间充质干细胞治疗组于同侧颈外动脉注射2×106个Brdu标记的、诱导过的骨髓间充质干细胞,磷酸盐缓冲液组接种同等体积磷酸盐缓冲液,对照组不接种,每组12只。③神经功能缺损评估:在模型制制作后,每3d采用Combs法进行神经功能评估,观察大鼠在行为学方面差异。④实验评估:制备大鼠脑组织石蜡切片,采用免疫组织化学方法检测骨髓间充质干细胞成活情况。结果:36只大鼠中每组各有2只于造模后48h内死亡,死因考虑为急性脑水肿和蛛网膜下腔出血,共30只大鼠进入结果分析。①各组大鼠神经功能缺损评分:骨髓间充质干细胞治疗组大鼠神经功能评分明显高于对照组和磷酸盐缓冲液组(3d:4.45±1.25,2.85±1.01,2.98±0.79;7d:6.67±2.12,4.47±1.08,4.56±1.27;14d:7.94±2.27,5.15±1.66,5.24±1.46,P<0.05)。②免疫组化染色检测骨髓间充质干细胞移植后成活情况:对照组和磷酸盐缓冲液组均未见到Brdu免疫组化阳性细胞着色,骨髓间充质干细胞治疗组各时间点均可见到Brdu阳性细胞,细胞呈圆形,较神经细胞小,阳性细胞主要见于缺血侧大脑皮质、皮质下和海马区。结论:①经颈动脉移植的骨髓间充质干细胞可在缺血性大脑损伤大鼠脑内存活、迁移。②经颈动脉移植骨髓间充质干细胞对缺血性脑损伤神经功能恢复有明显促进作用。     

Noggin基因修饰神经干细胞移植对局灶性脑缺血的研究

目的探讨Noggin基因修饰的神经干细胞移植到大鼠局灶性脑缺血处的迁移、分化及对神经功能损伤的修复作用。方法选取SD大鼠50只建立大脑中动脉梗塞模型,随机分为对照组10只,神经干细胞移植组、Noggin-神经干细胞移植组各20只,分别移植入10μl PBS、BrdU标记神经干细胞及Noggin-神经干细胞。移植前及移植后7d、14d、21d对各组大鼠进行NSS评分。25d时处死各组大鼠,脑组织免疫组化染色观察植入细胞的存活及分布情况。结果移植后各组NSS评分均下降,Noggin-神经干细胞移植组评分第14d、21d显著低于对照组及神经干细胞移植组,差异具有统计学意义(P0.05)。Noggin-神经干细胞移植组BrdU阳性细胞(126.8±5.46)个/HP,多于神经干细胞移植组(85.5±4.7)个/HP,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Noggin基因能促进神经干细胞在缺血区域的增殖、迁移与分化,对神经功能损伤的修复具有积极作用。     

局灶性脑缺血对内源性神经干及前体细胞增殖、分化和迁移的影响

背景正常成年动物中枢神经系统内存在能增殖、多向分化潜能的神经干细胞或神经前体细胞.在生理情况下,这些内源性神经干细胞或前体细胞处于静息状态.当脑缺血时,这些细胞将处于何种状态?目的研究大鼠局灶性脑缺血时,内源性神经干细胞的分布、增殖、分化.设计以大鼠为研究对象,随机对照的探索性研究.单位一所医学院的神经生物学研究室、组织胚胎学教研室.材料实验于2001-07/2002-07在泸州医学院神经生物学研究室完成.选择健康成年SD大鼠41只,雌雄不限,体质量250～300 g.干预阻塞大鼠大脑中动脉2 h再灌流0.5,3,6,12 h,1,2,3,5,10 d制成局灶性脑缺血模型,阻塞线不能阻塞大脑中动脉为假手术组,正常大鼠为对照组.在各时间点处死动物,制成脑组织切片,用免疫组织化学单标和双标观察内源性神经干细胞或前体细胞的增殖、分布、分化.主要观察指标内源性神经干/前体细胞的分布、分化.结果在正常组和假手术组多数脑室室管膜细胞增殖性细胞核抗原免疫反应阳性,脑实质内有零星散在增殖性细胞核抗原阳性细胞.再灌流3 h,增殖性细胞核抗原阳性细胞出现在嘴侧脑室下层.再灌流12 h以后,双侧侧脑室的一些脉络膜丛细胞增殖性细胞核抗原免疫反应阳性.再灌流3～10 d,视前区梗死区周边、纹状体、额顶皮质的增殖性细胞核抗原免疫反应阳性细胞显著增加.再灌流3 d,增殖性细胞核抗原阳性细胞开始出现于海马齿状回的颗粒下层,并随再灌流时间延长,增殖性细胞核抗原阳性细胞数量增多.免疫组化双标显示再灌流3 d视前区有很少量的增殖性细胞核抗原/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,随后增多.再灌流10 d内,未检查到增殖性细胞核抗原/神经丝双标阳性细胞.结论脑缺血时诱导内源性神经干细胞增殖、分化,并向缺血纹状体和皮质迁移,此现象有助于阐明神经功能康复的机制.     

电针对局灶性脑缺血成年大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

目的：研究成年大鼠脑缺血后缺血脑区神经干细胞增殖情况及电针干预对其影响,探讨电针治疗缺血性脑损伤的作用机制。方法：采用开颅热凝闭法制作大脑中动脉闭阻（MCAO）模型,随机分为模型组与电针组,缺血后用溴脱氧尿苷（BrdU）腹腔注射标记增殖的神经细胞。选用“大椎”、“百会”行电针干预,采用BrdU免疫组化观察脑缺血后第3d、7d、14d与21d四个不同时相BrdU阳性细胞数量的变化情况。结果：脑缺血后不同时相缺血侧皮质、齿状回、纹状体和SVZ均有BrdU阳性细胞,其中第7d的阳性细胞数量增加最为显著（P〈0．01）;而且电针组在不同时相的细胞数量均较同时相模型组有明显的增加（P〈0．05或P〈0．01）。结论：缺血可激发相关脑区神经干细胞的增殖。电针可起到促进作用,推论这种作用可能是电针治疗脑缺血的重要作用机制之一。     

人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布

目的:新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法.将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化.方法:实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成.①对象:神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定.清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×1011L-1,培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪.两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3 d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水.③实验评估:取未经PKH标记的细胞球, 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况.分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况.结果:在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%～90%.①神经干细胞的鉴定及分化:80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞.②神经干细胞植入后存活及分布情况:植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布.植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似.植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少.结论:在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广.     

电刺激小脑顶核联合神经干细胞共移植体治疗大鼠局灶性脑缺血

目的:观察局灶性脑缺血大鼠植入神经干细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对新生血管密度的影响。方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成。①实验分组:选取同一基因背景大鼠96只,随机数字表法分成4组:神经干细胞组、电刺激 神经干细胞组、神经干细胞共移植体组、电刺激 神经干细胞共移植体组,24只/组,移植后3,7,14,60d每个时间点各6只;另取新生24h内Wistar鼠1只用于神经干细胞的培养。共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定。②实验方法:各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激 神经干细胞组、电刺激 神经干细胞共移植体组于造模前1d行小脑顶核电刺激。以前囟为零点、正中线向后11.6mm、正中线向右1.2mm钻开颅骨后,用电针刺入脑内深5.6mm,给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率为0～100Hz,时程为0.5ms,连续刺激1h。各组均在造模后3d进行移植,移植部位为右侧纹状体缺血半暗带区。移植前分别将培养的神经细胞、神经细胞共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,细胞浓度调整为2×1010L-1。单纯神经干细胞组、电刺激 神经干细胞组植入神经干细胞悬液10μL,神经干细胞共移植体组、电刺激 神经干细胞共移植体组植入神经干细胞共移植体悬液10μL。③实验评估:各组分别于移植后3,7,14,60d腹腔麻醉取脑,制作石蜡切片,免疫组织化学法检测新生血管生成情况。结果:①新生血管免疫组织化学检测结果:新生血管是由单层扁平上皮细胞构成的,经免疫组化DAB显色后,新生血管内皮细胞的胞浆呈棕黄色,存在基底膜完整、不完整或无基底膜3种情况。②各种干预因素在不同时间点对新生血管生成的影响:各组在移植后3d均有新生血管生成,7d生成数量达到高峰,14d生成数量开始减少,至60d有较少的新生血管生成。以上各时间点电刺激 神经干细胞共移植体组新生血管密度均显著高于另外3组(F=7.12～15.86,P均<0.05)。结论:电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体移植能够促进大鼠局灶性脑缺血区新生血管的生成。     

局灶性脑缺血大鼠水通道蛋白 4的变化

背景细胞水肿与水的转运有关,水的转运与水通道蛋白( aquaporin、 AQP)密切相关,研究脑水肿与水通道蛋白关系,会为进一步阐述脑水肿的发病机制奠定基础. 目的探讨缺血性脑水肿后 AQP-4的变化,研究脑水肿的发病机制. 设计完全随机对照实验研究. 地点和对象实验地点为吉林大学第一医院.选用 Wistar雄性大鼠 42只,体质量 250～ 300 g,鼠龄 3～ 4月,按缺血时间随机分为 6 h, 1, 3, 5, 7, 14 d及假手术组,每组 6只. 干预参考 Longa等方法建立大鼠大脑缺血模型,苏木精-伊红染色观察组织病理学改变,应用免疫组化染色检测脑组织中 AQP-4的变化. 主要观察指标缺血组及假手术组脑组织病理表现及 AQP-4染色阳性细胞数. 结果在缺血 6 h组主要表现为神经元固缩,有轻度水肿.缺血 1 d组和 3 d组,神经元出现胞核崩解,胞浆淡染,同时出现明显的水肿,有的神经元只剩下淡红色的印记. AQP-4在缺血组织表达增强,缺血 6 h即增强 [(18.03± 1.51)个 /视野 ], 1 d时为 [(23.05± 2.01)个 /视野 ],3 d达高峰 [(38.14± 2.12) 个 /视野 ], 5 d时为 [(21.75± 1.80) 个 /视野 ],与假手术组比较,差异有显著性意义( t=14.88～ 29.32,P< 0.01) ,7 d恢复正常 [(9.03± 1.25) 个 /视野 ]. 结论 AQP-4是影响缺血性脑水肿的重要因素.     

永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体表达的鉴定

目的:阿片类物质可调控神经细胞的增殖和分化,为进一步明确阿片类物质对神经前体细胞的影响,对永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体的表达进行鉴定。方法:实验于2007-04/06在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室完成。通过反转录-聚合酶链反应及免疫荧光化学技术,分别从mRNA水平及蛋白质水平直接检测永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体的表达。另外将永生化神经前体细胞分别予以μ阿片受体激动剂吗啡及非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮处理,通过激光扫描共聚焦显微镜定量检测加药前、后永生化神经前体细胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration,[Ca~(2 )]_i)的改变,从而间接鉴定永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体的表达。结果:反转录-聚合酶链反应结果表明永生化神经前体细胞内有μ阿片受体mRNA存在,免疫荧光化学结果显示μ受体主要定位表达于永生化神经前体细胞细胞膜及细胞浆。受吗啡刺激后,永生化神经前体细胞内[Ca~(2 )]_i较刺激前显著增高(t=7.61,P<0.05);加入纳洛酮后[Ca~(2 )]_i亦呈显著增高趋势(t=4.96,P<0.05);待纳洛酮作用平稳后再加入吗啡,[Ca~(2 )]_i无明显改变(t=1.00,P>0.05)。结论:永生化神经前体细胞膜表面确有μ阿片类受体表达,这为从体外水平研究阿片类物质对神经前体细胞增殖及分化的影响提供了一种易于培养、稳定可靠的工具细胞系。     

补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞影响的初步研究

目的:观察中药补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后内源性神经干细胞(neuralstemcells,NSC)反应的影响探讨其可能机制。方法:84只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组,采用线栓法复制大鼠脑缺血模型,分别给予不同处理,于术后12h,1,3,5,7d处死动物,运用免疫组织化学方法检测脑缺血后各组NSC的激活。另取5只大鼠为正常对照组。结果:正常大鼠脑组织中存在少量NSC,主要分布在皮质区;脑缺血后,NSC增殖,以皮质、缺血周围区增加明显,健侧海马区可见NSC激活;1d开始增多,5d达高峰,模型组1,3,5,7dNSC数分别为(10.3±1.3),(14.2±1.7),(18.3±1.2),(16.4±1.6)个,补阳还五汤则分别为(10.8±1.1),(15.4±1.4),(23.5±1.1),(22.0±1.4)个,两组比较NSC数在5,7d时间点差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:局灶性脑缺血后,NSC激活、增殖,补阳还五汤能促进NSC的增殖。     

大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究

目的探讨树突状细胞( dendritic cells,DC)是否参与脑缺血损伤过程及在缺血脑组织中 DC的来源. 方法用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型.用免疫组化方法检测脑缺血 1 h到第 6 天时,缺血脑 DC( OX62+)的存在,以及胶质细胞 /巨噬细胞( OX42+)转化成 DC( OX62+),同时检测活化后的 DC样细胞表达主要组织相容性复合分子Ⅱ( MHCⅡ)情况. 结果脑缺血半球和假手术半球比较,在 1 h DC数量增加 (t=7.143, P< 0.001),在脑缺血组中,缺血脑半球与非缺血脑半球比, DC的数量也增多 (t=4.968, P< 0.01).脑缺血第 6天缺血组与假手术组进行比较, DC表达 MHCⅡ( OX62+ OX6+)显著差异,每 100 mm2脑组织切片中 OX62+ OX6+细胞数量比为 (53± 3)比 (33± 2)个 (t=2.975, P< 0.05).脑缺血半球在 1 h到第 6天 OX42+转变成 OX62+ OX42+细胞逐渐增加,脑缺血第 6天脑缺血半球与非缺血半球比 t=9.875, P< 0.001.脑缺血损伤面积与以每 100 mm2脑组织片为单位的 OX62+数量呈正相关 (R2=0.891 4,P< 0.001). 结论脑缺血后,脑缺血组织中 DC的数量增加, DC数量增加与脑伤面积呈正相关,提示 DC参与了脑缺血过程,大鼠脑缺血后从胶质细胞向 DC样细胞转化是脑内 DC的来源之一.     

脑温变化对大鼠局灶性脑缺血影响的病理研究

目的通过光镜、电镜观察,对比研究缺血前预高温和缺血后轻度高温、亚低温对局灶脑缺血早期脑组织病理形态演变的影响。方法64只Wistar大鼠按随机数字表法分为:轻度高温、常温假手术组,预高温、轻度高温、常温、亚低温缺血2h再灌注4h(O2R4)组及常温、亚低温缺血6h无灌注(O6R0)组(共8组,n=8),采用改良的Nagasawa局灶脑缺血模型,分别观察了脑缺血组织损伤的病理变化。结果与常温缺血组比较,轻度高温组脑缺血组织局部损伤加重,损伤范围最大;缺血前预高温和亚低温有改善脑缺血组织损伤的作用,该作用以亚低温O2R4组更明显,亚低温对O6R0组作用有限。结论轻度高温对缺血神经细胞向不可逆损伤和坏死演化、对损伤范围扩展均有促进作用;缺血前预高温和亚低温对暂时性脑缺血有明显保护作用,亚低温对持续性脑缺血无明显保护作用。