人IFN-β重组慢病毒的制备及对肺癌细胞增殖的影响

人β干扰素;;慢病毒载体;;基因转染;;A549细胞 %X 目的构建人β干扰素（IFN-β）基因重组慢病毒,体外转染人肺癌A549细胞,观察IFN-β基因的表达及其对A549细胞的增殖抑制作用。方法通过聚合酶链反应（PCR）获得人IFN-β基因,克隆到慢病毒载体,通过转染293细胞包装制备慢病毒液,并体外感染A549细胞,采用RT-PCR及Western Blot检测IFN-β基因在A549细胞中的表达情况。应用MTS法检测转染后对A549细胞增殖的影响。结果 IFN-β基因重组质粒经酶切后电泳结果显示能得到与理论大小相符的片段,基因测序结果与GenBank序列完全一致,重组质粒经鉴定正确,转染293细胞获得病毒滴度为3×107PFU/ml,体外感染A549细胞后,RT-PCR、Western Blot检测IFN-β表达水平明显增高,并可明显抑制A549细胞增殖。结论本研究成功构建IFN-β基因重组慢病毒,体外感染后能够稳定表达并抑制A549细胞增殖,为应用IFN-β基因治疗肺癌奠定初步基础。     

IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠细胞外基质积聚的影响

目的: 评价IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSCs)移植对肝纤维化大鼠细胞外基质(ECM)积聚的影响.方法: 利用免疫磁珠细胞分选(magnetic beadcell sorting, MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1++BDLSCs. 将腺病毒介导的IL-10基因转导至BDLSCs, 采用ELISA法检测IL-10蛋白分泌水平. 将大鼠随机分为4组: 正常组、模型组、BDLSCs组及BDLSCs/IL-10组. 采用PCR法检测Y染色体性别决定基因Sry; 采用VG染色法观测肝组织胶原沉积面积; Western blot法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin, α-SMA)表达; 采用碱水解法检测肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)浓度; ELISA法检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等细胞外基质含量.结果: MASC法能成功分选纯化BDLSCs.IL-10修饰BDLSCs持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外, 移植后能顺利种植于肝内, 减轻胶原沉积, 减少α-SMA表达从而抑制肝星状细胞活化, 与BDLSCs组比较, BDLSCs/IL-10组大鼠肝组织Hyp水平显著降低(255.0±50.5 μg/gvs 373.0±26.7 μg/g, P<0.01), 血清HA, LN及PCⅢ水平也有所降低, 差异具有统计学意义(40.5±7.7 μg/L vs 79.4±10.3 μg/L, 61.5±16.4 μg/L vs 77.7±12.6 μg/L, 14.3±0.8 μg/Lvs 14.9±1.5 μg/L, P<0.01或0.05).结论: IL-10基因修饰BDLSCs移植能有效减少肝纤维化大鼠ECM的积聚, 为治疗肝纤维化提供了新思路.     

大鼠肝细胞生长因子shRNA慢病毒载体的构建及其效应研究

目的:构建和鉴定大鼠肝细胞生长因子(HGF)shRNA慢病毒载体,为在分子水平进一步研究HGF对巨核细胞成熟与分化能力的影响提供方法。方法:设计并人工合成4对大鼠HGF的shRNA,与酶切后的GV115载体质粒连接,扩增后与辅助质粒共转染293T细胞,收取上清病毒液;PCR检测其在大鼠肾细胞内的干扰效应。结果:阳性克隆电泳结果为341bp,测序分析显示4组质粒中插入的核苷酸序列均为相应的大鼠HGF shRNA序列,GV115-shHGF质粒构建正确;慢病毒滴度为4×108 TU/ml。经PCR鉴定,4组shHGH慢病毒转染目的细胞后,与空白对照组比较,HGF相对表达量分别为:1.99、0.30、0.19、2.41。结论:靶向大鼠HGF的shHGF3慢病毒载体具有最佳的干扰HGF表达的效率。     

携带Foxp3基因慢病毒载体的构建

目的构建携带叉头样转录因子p3（Foxp3）基因的重组慢病毒载体PWPXL-MOD-Foxp3,并包装成慢病毒,为体外获得CD4＋CD2＋5调节性T细胞（CD4＋CD2＋5 Tregs）奠定基础。方法采用双酶切法构建慢病毒表达载体PWPXL-MOD-Foxp3,用磷酸钙沉淀法将包装慢病毒所需的四质粒系统共转染人胚肾细胞293T,慢病毒系统转染48h后收集病毒上清液,纯化、浓缩后采用流式细胞术测定慢病毒滴度。结果重组的慢病毒载体滴度为3.3×108IU/ml。结论成功构建了含有Foxp3基因的高滴度的慢病毒载体,为体外获得CD 4＋CD 2＋5 Tregs奠定基础。     

Cx43基因shRNA慢病毒载体的构建及其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用

目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。     

慢病毒重组ACE2基因表达载体的构建及其感染人脐静脉内皮细胞的研究

目的构建携带血管紧张素转换酶2（ACE2）基因的慢病毒表达载体,观察其感染人脐静脉内皮细胞后ACE2基因的转录及表达水平。方法采用PCR技术从含有ACE2基因的质粒克隆模板pc—DNA3．1-hygro（＋）一mACE2上钓取ACE2基因,并将ACE2基因重组到慢病毒载体表达质粒pGC—FU中,构建重组慢病毒载体表达质粒pGC—FU—ACE2,通过酶切、测序验证ACE2基因后,将pGC—FU—ACE2质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ACE2基因的重组慢病毒Lentiviral—ACE2;然后感染人脐静脉内皮细胞,通过RT—PCR、Western—blot检测ACE2基因的转录和蛋白表达水平。结果成功构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2,并获得大量高纯度的慢病毒浓缩液。目的基因ACE2能被重组慢病毒高效地导入人脐静脉血管内皮细胞,并能高水平表达。结论慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2成功构建并能高效率感染人脐静脉内皮细胞,为研究ACE2对血管内皮细胞的影响和更深入地探索ACE2基因的功能奠定了基础。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨携带脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase,POP)基因的慢病毒转染大鼠肝星状细胞系-T6(hepatic stellate cellsT6,HSC-T6)对其生物学功能的影响,以揭示其在肝脏炎症与纤维化发生、发展中的作用。方法采用大鼠HSC-T6作为研究对象,设计合成携带大鼠POP基因的慢病毒,转染HSC-T6;通过ELISA方法检测各组HSC内Ac-SDKP水平;Real-time-PCR法检测各组HSC内相关基因表达量变化(POP、TGF-β1、α-SMA、MCP-1、Col I);Western blotting方法检测各组HSC中相关蛋白表达变化(POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ);CCK-8和流式细胞术检测转染POP对HSC增殖和凋亡的影响。结果慢病毒能高效感染HSC-T6并表达有活性的POP蛋白,与正常对照组及空病毒组相比,POP慢病毒感染的细胞内Ac-SDKP明显升高,Smad7、PPAR-γ蛋白表达显著升高,而α-SMA表达显著下降;POP慢病毒感染的细胞内MCP-1及α-SMA mRNA表达显著下调;此外,POP可促进HSC-T6增殖生长,而对HSC-T6凋亡无影响。结论 POP在HSC内可能发挥抗炎、抗纤维化作用,其机制可能通过促进Smad7及PPAR-γ的表达,抑制MCP-1及α-SMA的表达而发挥作用。     

大鼠Cx43基因慢病毒表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞表达的观察

目的:构建大鼠缝隙连接蛋白43(Cx43)基因的重组慢病毒表达载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),观察Cx43的表达。方法:采用RT-PCR技术获得大鼠Cx43基因,并将其连接到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pGC-FU中,重组获得慢病毒质粒pGC-FU-Cx43,将其与辅助包装质粒(pHelper1.0、pHelper2.0)一起共转染293T细胞,包装生产病毒并测定滴度。所获慢病毒感染大鼠BMSC后,采用荧光显微镜和Western blot方法检测Cx43的表达。结果:酶切证实Cx43基因已定向连入目的载体,测序结果显示,所构建的pGC-FU-Cx43重组慢病毒质粒序列与目标序列完全一致。获得的病毒滴度为2×109TU/ml。经分离、纯化得到BMSC;pGC-FU-Cx43转染BMSC后,可见大量EGFP表达,Cx43的表达量明显增加。结论:成功构建并包装获得较高滴度的重组慢病毒pGC-FU-Cx43。pGC-FU-Cx43可高效转染BMSC,Cx43表达增加,且实现稳定转染。     

人肿瘤抑素Tumstatin基因慢病毒表达载体的构建及其蛋白表达

目的 构建Tumstatin基因慢病毒表达载体,进一步研究Tumstatin基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用.方法 采用PCR技术从含有Tumstatin基因的质粒pSPORT1-Sfi扩增目的 基因Tumstatin,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒PGC-Fu[含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum,通过酶切、测序验证Tumstatin基因后,将pGC-FU-Tum质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelpe2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Tumstatin基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-Fu-Tum,并转染人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,Wstem blot检测目的 蛋白Tumstatin的表达.结果 pGC-FU-Tum中携有正确的Tumstatin基因;pGC-FUTurn共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒GC-FU-Tum;目的 基因Tumstatin能被重组慢病毒高效地转导入HUVEC,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,Western blot能检测到Tumstatin蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带Tumstatin基因的重组慢病毒载体;其蛋白表达与EGFP-致..     

过表达HSP20的慢病毒载体对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的构建过表达大鼠热休克蛋白20(HSP20)基因慢病毒载体,探讨其对H2O2诱导的大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠HSP20基因pHIV-HSP20过表达质粒慢病毒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其转染效率;包装慢病毒并转染H9C2心肌细胞;72 h后观察其转染效率,RT-PCR法检测细胞HSP20 mRNA表达,CCK-8、Hochest33258染色法检测H2O2诱导后H9C2心肌细胞凋亡情况。结果成功构建了HSP20慢病毒过表达载体,经293FT细胞包装后,其对H9C2细胞72 h的转染效率为95%;与慢性病毒组比较,H9C2细胞转染72 h后HSP20 mRNA水平显著升高,细胞活力下降,心肌细胞凋亡率明显降低(P均<0.01)。结论过表达HSP20能显著抑制H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4骨髓间充质干细胞

目的:用慢病毒载体及基因开启构建过表达GATAG-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法:将已构建成功的GATA-4基因插入慢病毒包装质粒GV308中,构建GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒。将构建成功的GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒转染入小鼠BMSCs,并加入基因开启剂强力霉素(DOX)。转染成功后利用RT-PCR及Wstern blot法检测转染24、48、72hGATA-4基因量的表达及转录因子GATA-4的表达。结果:RT-PCR及Western blot实验均提示,随着转染时间的延长,GATA-4在小鼠BMSCs内的表达量是增加的。结论:利用慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4小鼠BMSCs成功。     

大鼠HO-1基因重组慢病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建大鼠血红素加氧酶1 (HO-1)基因重组慢病毒载体lenti EGFP-HO-1,并检测其在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达效率.方法 利用聚合酶链反应技术(PCR)扩增rat-HO-1基因,并克隆到pGV287 EGFP载体中,行PCR及测序鉴定所构建的重组质粒pGV287-EGFP-HO-1;将重组质粒pGV287-EGFP-HO-1及辅助包装质粒pHelper 1.0、pHelper 1.0共转染293细胞进行重组慢病毒lenti-EGFP HO-1的包装,并采用荧光标记法检测病毒滴度,再进一步感染BMSC,荧光显微镜下观察感染效果、Western blot检测BMSC内HO-1表达情况.结果 大鼠HO-1基因扩增产物大小为911 bp,与目的基因相关片段中HO1 cDNA大小一致.阳性克隆行PCR后形成498 bp,其大小与目的片段大鼠HO-1 cDNA相当,进一步测序鉴定提示与GenBank信息库中rat-HO-1基因mRNA一致.重组慢病毒lenti-GV287-EGFP-HO1滴度为2×108 TU/ml,感染BMSC后可观察到报告基因EGFP表达,慢病毒lenti-GV287-EGFP-HO-1感染组中可检测到HO-1蛋白表达.结论 本研究成功构建了重组慢病毒载体lenti-GV287-EGFP-HO-1,并能够在BMSC中高效表达,为进一步探索HO-1基因修饰间充质干细胞在肺损伤中的作用奠定了基础.     

大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察该载体对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)CBP表达的沉默效应。方法设计合成4条CBP基因的siRNA序列,将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU-GW-iRNA载体连接产生CBP shRNA慢病毒表达载体,转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs,实时定量RT-PCR检测CBP mRNA的表达,并与未转染及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞进行比较。结果 PCR扩增和测序结果证实,成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×10~9 TU/ml,与未转染慢病毒及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞比较,CBP shRNA慢病毒转染可使VSMCs的CBP mRNA分别下降88.5%和92.7%。结论成功构建CBP基因RNAi慢病毒表达载体,对VSMCs的CBP表达具有良好沉默作用,为后期基因治疗血管增殖性疾病奠定基础。     

AQP5基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人水通道蛋白5（AQP5）基因慢病毒载体。方法体外扩增出AQP5基因全长cDNA,将慢病毒载体pWPTS-GFP与扩增出的AQP5用MluⅠ和SalⅠ进行双酶切,将AQP5全长序列克隆入pWPTS-GFP,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对长出的克隆用菌落PCR鉴定,再对阳性克隆进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒通过CaCl2共转染293T细胞（人胚肾细胞）,培养48 h后收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在工具细胞SGC7901细胞（胃癌细胞）的转染效率。Western blot检测SGC7901细胞中AQP5蛋白。结果测序结果和Western blot检测均证明AQP5重组慢病毒载体构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染SGC7901细胞。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×108 TU/ml。结论成功构建了稳定表达AQP5基因的重组慢病毒载体。     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

解偶联蛋白-2基因过表达慢病毒载体的构建

目的构建解偶联蛋白-2（UCP-2）基因慢病毒表达载体。方法用RT-PCR技术从转基因肥胖小鼠肝脏组织中获得UCP-2基因编码区片段,用In-Fusio技术将PCR产物连接入Age I单酶切后的慢病毒转移质粒体pGC-FU,进行鉴定及序列测定。将构建成功的转移质粒和两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、Helper2.0（VS-VG元件）共转染293T细胞,包装成慢病毒,浓缩纯化后检测滴度。结果RT-PCR产物经电泳证实成功获取UCP-2基因cDNA克隆,鉴定证实慢病毒转移质粒连接构建正确,病毒包装滴度为2×108TU/ml。结论成功构建了UCP-2基因慢病毒表达载体。     

BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的 构建BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体及获得稳定表达BHRF1的慢病毒的方法.方法 通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法从鼻咽癌组织中扩增获得BHRF1的基因全长CDS序列,并克隆于带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体中,酶切验证测序正确后,将质粒pWPXL-hBHRF1-IR ES-GFP与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察下293T细胞的绿色荧光表达及转染效率.结果 电泳鉴定与目的基因表达条带完全吻合,测序结果显示扩增得到的BHRF1序列与GenBank公布的参考序列完全一致,双酶切和测序结果证明BHRF1已正确地克隆到慢病毒表达载体中,包装后慢病毒颗粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光表达,转染效率＞90％.结论 成功构建了BHRF1与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究BHRF1基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

比较不同方法肝脏靶向性导入抗TGF-β_1 siRNA对肝细胞TGF-β/Smad信号传导通路的影响

目的比较抗TGF-β1 siRNA靶向性进入肝细胞的4种转染方式在抗肝损伤与纤维化及对TGF-β/Smad信号传导通路影响中的效果差异,并探讨各自的优劣。方法已启动肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的50只模型鼠,随机分为模型对照组、尾静脉直接注射组、脂质体包裹组、流体动力学法组和肝动脉插管组,每组10只;将构建的TGF-β1 siRNA质粒分别通过尾静脉直接注射、脂质体包裹、流体动力学法、肝动脉插管等方式导入肝脏靶细胞;分别检测血清指标ALT、AST、HA;取肝组织,HE染色病理检测;RT-PCR技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1和Smad3 mRNA表达;免疫组化技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β和Smad3蛋白表达。结果抗TGF-β1siRNA质粒经过以上4种导入方法转染入靶细胞,均能有效地阻断大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的传导（P〈0.05）;4种导入方法比较,肝动脉插管组与脂质体包裹组效果相当（P〉0.05）,优于尾静脉直接注射组及流体动力学法组（P〈0.05）,尾静脉直接注射组效果最差（P〈0.05）。结论抗TGF-β1siRNA质粒经肝动脉插管途径转染,是一种安全、高效的外源基因肝脏靶向导入转染方法。     

转化生长因子βⅠ型受体基因的靶向小干扰RNA抑制肝星状细胞合成胶原的体外研究

目的 观察大鼠转化生长因子βⅠ型受体(TβR Ⅰ)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)表达质粒对肝星状细胞(HSC)合成胶原的影响.方法 根据大鼠Tβ R Ⅰ的基因序列,设计并构建3个大鼠TβR Ⅰ基因的靶向siRNA表达质粒,以脂质体作转染试剂,将siRNA表达质粒分别转染至HSC-T6细胞中,RT-PCR和Western印迹技术分析TβRⅠ mRNA及蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,放射免疫法测HA、PCⅢ含量.采用LSD法进行统计学处理.结果 酶切证实siRNA的目的 基因片段已成功克隆入载体中.与空白对照组比较,转染siRNA表达质粒后,3组HSC-T6细胞TβR Ⅰ mRNA表达水平均抑制,其中以psiRNA2组抑制作用最强(psiRNA1组:t=7.354,P＜0.01;psiRNA2组:t=9.214,P＜0.01;psiRNA3组:t=5.967,P＜0.01).3组TβRⅠ蛋白表达水平均降低,以psiRNA2组降低最明显(psiRNA1组:t=6.324,P＜0.01;psiRNA2组:t=8.741,P＜0.01;psiRNA3组:t=4.128,P＜0.01).3组HSC-T6细胞增殖活性均下降,合成胶原均减少,以psiRNA2组最明显;而转染无关siRNA组无明显变化.结论 构建的TβR Ⅰ siRNA表达质粒可抑制HSC-T6细胞合成胶原,为肝纤维化基因治疗提供新的靶点.