大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的 研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件，探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法 采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞，观察在化学限定培养条件下，肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果 肝细胞培养时间进程显示：10mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞^3H—TdR掺入作用，在60和84h出现2个DNA合成峰；2％DMSO抑制^3H-TdR掺入，但在NA共同作用下，肝细胞在132h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示：HPN NA DMSO培养72h时肝细胞为正常二级分裂，168h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论 NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖，所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究，并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

肝细胞生长因子和表皮生长因子对体外肝细胞生长的影响

取成年小鼠肝细胞在RPMI1640培养液中加热60℃胎肝提取液(FE_(60)HSS),加热80℃胎肝提取液(FE_(80)HSS)及加热60℃成年雄性小鼠颌下腺提取液(M_(60)EGF),用I~(125)UdR掺入法测定其肝细胞DNA合成,结果显示FE_(60)HSS为8575±17cpm,FE_(80)HSS为4788±990cpm,M_(60)EGF为4592±1120cpm,和对照组1902±657cpm比较差异有非常显著意义(P值均<0.01)。FE_(60)HSS组对细胞DNA合成较FE_(80)HSS明显,说明HSS对加热80℃不很稳定。     

肝细胞生长因子体外抑制SMMC-7721人肝细胞癌细胞生长

目的 :观察肝细胞生长因子 (HGF)对体外培养的人肝细胞癌细胞的生长效应。方法 :将处于指数生长期的SMMC 772 1细胞经过 (HGF处理组 )或不经 (对照组 )HGF处理培养 1～ 4d ,采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测细胞数 ,并进行细胞周期分析。结果 :HGF对SMMC 772 1细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用。在实验浓度内 ,使用最高浓度的HGF(rhHGF为 2 0 μg·L-1、cHGF为 10 0mg·L-1)对细胞增殖抑制作用最强。使用不同浓度 (5、10、2 0 μg·L-1)rhHGF处理 3d的培养细胞均有一半以上停留在G0 /G1期。结论 :HGF对SMMC 772 1人肝细胞癌细胞的体外生长有强烈的抑制作用 ,这与细胞生长阻滞在G0 /G1期有关。     

MTT法检测异种肝细胞生长因子对大鼠肝细胞体外增殖的影响

目的 :研究肝细胞生长因子对大鼠肝细胞原代培养的影响。方法 :利用胶原酶原位二步灌注法分离大鼠肝细胞 ,接种并预培养 1 .5 h后 ,用含不同浓度 HGF的培养基继续培养至 48h,MTT比色法检测肝细胞生长因子对原代培养大鼠肝细胞增殖的影响。结果 :在所设加样量范围内 ,培养基所含 HGF为 1 0 μg/m L时 ,原代培养大鼠肝细胞的增殖出现最高峰。结论 :HGF对原代培养的大鼠肝细胞的增殖有明显的影响 ,但其作用效果无剂量依从关系     

生长激素、肝细胞生长因子和烟酰胺对人胎胰岛细胞体外增殖的影响

目的 :探讨生长激素 (GH) ,肝细胞生长因子 (HGF)和烟酰胺 (NIC)对体外培养人胎胰岛细胞增殖的影响。方法 :胶原酶消化法制胰岛样细胞团 (ICCs) ,接种于 2 4孔培养板培养 ,在实验组中分别加入GH(1 0 0 μg/L) ,HGF(2 5 μg/L)和NIC(1 0mmol/L)及其组合 ,同时设空白组为对照 ,间日调换培养液并测定胰岛素分泌量 ,于培养 6d末测定胰岛细胞内胰岛素含量 ,收集细胞计数 ,观察细胞有丝分裂相及胰岛细胞分布情况。结果 :①在人胎胰岛细胞体外培养第 2d、第 4d、第 6d胰岛素分泌量各实验组均高于空白组 (P <0 .0 1 ) ,以GH +HGF +NIC组最高 ,GH +HGF +NIC组与GH +NIC组、GH +HGF组、HGF +NIC组相比 ,差异无统计学意义 ,但与GH组、HGF组、NIC组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。②各组胰岛细胞内胰岛素含量与胰岛样细胞团数均呈正相关 ,r均大于 0 .80 (P <0 .0 5 )。结论 :GH、HGF、NIC均能显著促进体外培养的人胎胰岛细胞的增殖 ,胰岛素含量及分泌量增加 ,3者有协同作用。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞

目的：研究HGF、aFGF及OSM诱导MSCs成为肝细胞的能力及其在分化中的作用。方法：用HGF、aFGF、OSM诱导分化MSCs后,用化学发光法、RT—PCR法及谷氨酸脱氢酶法检测细胞AFP、ALB及尿素的表达情况。结果：除对照组外其余各组细胞均有AFP表达（P〈0．05）;对照组及a＋O组无ALB、尿素的表达,其余各组出现ALB及尿素的表达（P〈0．05）。结论：HGF联合aFGF、OSM及aFGF能够诱导MSCs分化为表达AFP、ALB、尿素的肝细胞;aFGF与OSM在没有HGF存在时不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化。     

肝细胞生长因子和肝细胞生长抑制物质的分离

①目的用改良亲和层析法从人胎盘中分离肝细胞生长因子和肝细胞生长抑制物质。②方法取３０ｇ人胎盘加４倍体积（Ｗ／Ｖ）的缓冲溶液，匀浆，４℃，离心（１１０００ｒ／ｍｉｎ）３０ｍｉｎ，收集上清液；用４５％饱和度硫酸铵进行盐析。沉淀复溶后对洗脱缓冲溶液透析２０ｈ，再进行Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ凝胶过滤柱层析。最后，将层析第２峰过肝素－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ亲和层析柱，用改良的洗脱方法进行亲和层析。③结果在分离肝细胞生长因子的同时，还分离得到一种肝细胞生长抑制物质。肝细胞生长因子可明显刺激原代培养的大鼠肝细胞ＤＮＡ的合成（ｔ＝６４８．３９，Ｐ＜０．０１），而肝细胞生长因子则抑制原代培养的大鼠肝细胞的ＤＮＡ合成（ｔ＝－１０．４４，Ｐ＜０．０１）。④结论改良亲和层析法在分离效率方面比传统方法有明显提高，而用该法分离到的肝细胞生长抑制物质可能参与了肝细胞的发育调节。     

Establishment and growth regulation of rat hepatocyte colony in vitro]

OBJECTIVE: To investigate the conditions essential for culturing hepatocytes colony in vitro, and to study the growth regulation mechanisms of hepatocyte colony. METHODS: Rat hepatocytes were isolated by two-step in situ preperfusion and collagenase circulatory perfusion. The effects of hepatopoietin (HPN), nicotinamide (NA) and dimethyl sulfoxide (DMSO) on DNA synthesis, mitotic activity, morphology (under inverted microscope) and utrastructure (under TEM) of the hepatocytes were investigated in chemically defined culture medium. RESULTS: The time course of DNA synthesis in cultured hepatocytes showed that 3H-TdR incorporation was dramatically enhanced by 10 mmol/L NA, presenting 2 peaks at 60 and 84 h respectively. The plateau of DNA synthesis was diminished in the presence of DMSO, but a peak occurred again at 132 h upon NA treatment. After cell culture in the presence of HPN, NA, and DMSO for 72 h, the hepatocytes presented sustained regular bipolar mitosis, with considerable mitotic activity at 168 h. The growth characteristics of hepatocyte colony, in addition to its potential for expansion, were captured by both light and electron microscopy on day 28 of cell culture. CONCLUSION: The reciprocal actions of NA and DMSO can control the proliferation of HPN-stimulated hepatocytes, which can be used for studying human hepatocyte metabolism, cytotoxicity, biotransformation and mutagenesis, and may provide experimental evidences for the treatment of liver failure and genetic liver diseases with in vitro hepatocyte clones.     

重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用RT PCR技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子 (HGF)cDNA基因 (2 184bp) ,并将其克隆至pGEM T载体 ,经限制性核酸内切酶NdeⅠ ,Bg1Ⅱ ,HindⅢ ,BamHⅠ和XhoⅠ的酶谱分析和DNA测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体pLNL XHC ,可进一步用于基因表达和基因治疗的研究     

肝切除后大鼠Ito细胞肝细胞生长因子mRNA表达的变化

目的：探讨Ito细胞在大鼠肝再生中的作用一方法：分离大鼠2／3肝切除术后不同时间(6h、12h、24h)以及未切除肝的Ito细胞，提取其总RNA，采用半定量RT-PCR方法检测其肝细胞生长因子(HGF)mRNA的表达。结果：分离的Ito细胞纯度达91％．肝2／3切除术后大鼠6h、12h和24h分离的Ito细胞HGF mRNA的表达较未切除组分别升高了14．6倍、21．1倍和11倍结论：Ito细胞在肝大部分切除大鼠早期表达HGF mRNA升高，表明其在肝再生启动过程中具有重要作用。     

肝细胞生长因子对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究

目的观察肝细胞生长因子(HGF)对子宫内膜癌细胞HEC-2B增殖的影响及子宫内膜癌细胞HEC-2B中HGF受体C-met的表达,了解HGF对子宫内膜癌细胞的作用及其机制。方法体外培养人子宫内膜癌细胞HEC-2B,用RT-PCR的方法检测HEC-2B中HGF受体C-met有表达。对HEC-2B进行24 h血清饥饿后用不同剂量的HGF作用于HEC-2B。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析细胞的增殖力,用流式细胞仪检测细胞的增殖周期。结果C-met在HEC-2B细胞中稳定表达,HGF促进细胞的增殖,并在一定的范围内有剂量依赖关系,各处理组与对照组相比,P<0.05。当HGF浓度达到60 ng.mL-1时,增殖水平较对照上调约1.9倍。结论HGF/C-met能够在体外促进子宫内膜癌细胞的增殖。     

肝细胞生长因子（HGF）在胎儿各脏器的分布

本实验应用免疫组织化学法，研究人肝细胞生长因子在６－７个月胎儿各脏器的分布情况，结果显示了ＨＧＦ大量分布于胎儿的肝脏，其中以较小的、核深染的肝细胞为主。在肾脏，ＨＧＦ呈中等量分布。在胃、十十指肠、胰腺、肾上腺等ＨＧＦ只有少量的分布。     

肝细胞生长因子对培养大鼠系膜细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对培养大鼠肾小球系膜细胞转录及表达低密度脂蛋白(LDL)受体的影响.方法:以10、20、50、100 ng/ml HGF与大鼠系膜细胞在高LDL环境(250 μg/ml)中共孵育,应用RT-PCR及酶联免疫吸附方法,观察大鼠系膜细胞LDL受体的转录与表达的变化.结果:HGF可时间依赖及浓度依赖地在转录水平与蛋白水平增加培养大鼠系膜细胞LDL受体表达,并且不被高LDL环境所抑制.结论:HGF通过促进系膜细胞表达LDL受体,增加系膜细胞对LDL的摄取,可能参与了脂质肾损伤过程.     

肝细胞生长因子体外对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对肝癌细胞 HepG2 增殖和凋亡的影响. 方法: 人肝癌细胞株 HepG2加入不同浓度HGF(0, 1, 10, 50 μg/L) 培养2, 4, 6 d,应用MTT 法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡百分率的变化,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达. 结果: HGF 抑制 HepG2 细胞增殖呈剂量及时间依赖性,并诱导其凋亡[50 μg/L HGF,培养时间为4, 6 d,其抑制率: (30.7±10.2)%, (49.8±11.1)% vs 1 μg/L HGF: (10.7±11.2)%, (4.2±9.4)%; P《0.05, P《0.01]. 随着HGF浓度增大S期细胞明显减少[试验组10, 50 μg/L HGF: (7.5±4.4)%, (7.8±1.6)% vs对照组0 μg/L HGF: (16.6±2.8)%; P《0.05, P《0.01],同时可见G0/G1 期细胞累积现象[试验组10, 50 μg/L HGF: (80.5±3.2)%, (73.1±3.9)% vs对照组0 μg/L HGF:(59.6±6.2)%; P《0.05, P《0.01]. 试验组 G1 峰前出现明显的凋亡峰,凋亡率亦较对照组显著增加(P《0.05). 且试验组细胞 PCNA 表达明显高于对照组. 结论: HGF 对肝癌细胞 HepG2 有抑制增殖和诱导其凋亡的作用,诱导细胞 G0/G1 期阻滞为可能机制之一.     

肝细胞生长因子在大鼠肾小管间质纤维化中的表达及意义

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)在肾小管间质纤维化过程中的表达及意义。方法雄性3月龄SD大鼠60只,随机分为对照组和模型组各30只,以腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾小管间质纤维化模型,对照组以等体积的2%淀粉溶液灌胃,分别于实验第7周、12周、17周时随机处死10只大鼠,进行血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN),24 h尿蛋白定量和尿NAG酶检测,光镜下观察肾组织的病理变化及免疫组织化学法检测肾脏HGF、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)的表达情况。结果与对照组比较,模型组各时相点大鼠尿蛋白、尿NAG酶、血Cr及血BUN均升高(P<0.01);7周时模型组即有肾小管间质损害,随着病程进展,肾小管间质损害逐渐加重;肾脏HGF表达7周、12周时增加,17周时降低;与TGF-β1、α-SMA表达呈负相关(r=-0.999,P<0.01;r=-0.980,P<0.01)。结论肾小管间质纤维化过程中,肾脏HGF的表达早期上升是一种有益的防御反应。HGF抑制TGF-β1、α-SMA的表达,发挥其抗纤维化作用。