RNA干扰沉默MIF基因对HeLa细胞生长、迁移和黏附性的影响

目的:探讨巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)对宫颈癌HeLa细胞生长、迁移和黏附能力的影响.方法:通过反转录病毒载体介导RNA干扰,获得稳定抑制MIF表达的HeLa细胞株.Western印迹法检测MIF蛋白沉默效果以及FAK、ICAM-1、Bax和Bcl-2蛋白表达情况.观察HeLa细胞生长状态的变化,采用迁移实验、黏附实验和软琼脂糖克隆形成实验检测MIF对HeLa细胞迁移和黏附能力的影响.通过裸鼠成瘤实验观察沉默MIF基因后HeLa细胞的成瘤效果.肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)和放线菌酮(cycloheximide,CHX)诱导细胞凋亡后,FCM法检测沉默MIF基因对HeLa细胞凋亡的影响.结果:构建获得稳定抑制MIF蛋白表达的HeLa-pSUPER-MIF细胞株.MIF基因沉默后细胞生长减慢,迁移能力和黏附功能减弱;HeLa细胞中FAK、ICAM-1的表达量减少,无法在裸鼠中形成肿瘤;同时能减少TNF-α 和CHX诱导的细胞凋亡,并且使Bax表达量下降.结论:MIF通过影响HeLa细胞中FAK、ICAM-1的表达,促进肿瘤细胞生长,增加肿瘤细胞的迁移和黏附能力,因此MIF可能是肿瘤形成过程中的重要因子.     

MIF重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞及其对CyclinD1表达的影响

目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor, MIF）重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞后MIF的表达及其对CyclinD1表达的影响。方法 构建并鉴定重组真核表达质粒pEGFP-N1-MIF,转染人宫颈癌SiHa细胞;ELISA法检测细胞上清液中MIF的表达;real-time PCR及免疫细胞化学法检测细胞中MIF、CyclinD1 mRNA及蛋白的表达水平;MTT法及Boyden小室法分别检测细胞增殖和体外迁移能力。结果 重组质粒pEGFP-N1-MIF成功构建并转染至SiHa细胞;ELISA证实转染pEGFP-N1-MIF的实验组细胞上清液中MIF表达均高于各对照组（P<0.01）;real-time PCR及免疫细胞化学法证实实验组细胞中MIF、CyclinD1 mRNA和蛋白的表达水平均高于各对照组（P<0.01）;MTT法和Boyden小室法检测到转染pEGFP-N1-MIF后细胞体外增殖、迁移能力明显高于各对照组（P<0.01）。结论 转染重组质粒pEGFP-N1-MIF后SiHa细胞中MIF表达水平增高,MIF过表达可增强SiHa细胞体外增殖、迁移能力,并上调 CyclinD1的表达。     

过表达巨噬细胞移动抑制因子对子宫颈癌SiHa细胞上皮间质转化的影响

目的 探讨过表达巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对子宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化 （EMT）的影响.方法 应用基因转染方法将重组质粒pEGFP-N1-MIF转入SiHa细胞,构建过表达MIF的SiHa细胞;用实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫细胞化学方法分别检测各组细胞中E-cadherin、vimentin mRNA及蛋白的表达水平.结果 RT-PCR检测结果显示,转染pEGFP-N1-MIF的细胞中MIF mRNA相对表达量升高（F=2950.278,P＜ 0.01）;转染pEGFP-NI-MIF的细胞中vimentin的mRNA高于各对照组,而E-cadherin的mRNA低于各对照组（F值分别为2 135.048,1 893.563,均P＜0.01）;转染pEGFP-N 1-MIF的细胞中vimentin的蛋白表达水平高于各对照组,而E-cadherin的蛋白表达水平低于各对照组（F值分别为2 348.021,1 789.421,均P＜ 0.01）.结论 过表达MIF促进SiHa细胞中vimentin表达,抑制E-cadherin表达,说明过表达MIF促进子宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化.     

小干扰RNA靶向MIF对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响#br#

目的探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响。 方法取对数生长期的SGC 7901细胞,采用脂质体法分别转染靶向人MIF的siRNA（siMIF组）或阴性对照序列（NC组）,48 h后采用Western blotting检测MIF蛋白的表达情况,MTT法观察转染后24、48、72 h的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后72 h的细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达变化。 结果siMIF组转染48 h后的MIF相对表达量为0321±0104,低于NC组的1078±0212,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组转染48～72 h后的细胞增殖率低于NC组,差异有统计学意义（P＜005）。转染MIF siRNA 72 h后,siMIF组的细胞凋亡率为（235±36）％,高于NC组的（47±17）％,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组Bcl 2的相对表达量为0663±0209,低于NC组的1129±0178,而Bax相对表达量为0981±0225,高于NC组的0587±0254,以上差异均有统计学意义（P＜005）。 结论siRNA靶向沉默MIF能够降低SGC 7901细胞中MIF蛋白表达,抑制SGC 7901细胞的增殖并促进凋亡,在胃癌的靶向治疗中有一定前景。     

RNA干扰技术沉默宫颈癌Hela细胞Survivin基因对细胞生物学特点的影响

目的:通过RNA干扰技术沉默宫颈癌Hela细胞中的Survivin基因,观察干扰后核酸表达及细胞凋亡情况发生的变化,为进行宫颈癌的基因治疗提供理论依据.方法:设定空白组、阴性对照组及实验组,空白组Hela细胞未进行基因干扰,阴性对照组为非特异序列干扰,实验组为针对Survivin基因设计的干扰RNA(siRNA)干扰,每组均设三个平行标本.转染后48h收集细胞,RT-PCR技术检测Survivin mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:转染siRNA 48h后,Hela细胞中Survivin mRNA拷贝数明显减少,实验组mRNA表达量为空白组的23.4％,存在显著性差别(P＜0.01);为阴性对照组的23.3％,存在显著性差别(P＜0.01).流式细胞术检测结果表明,实验组Hela细胞凋亡率是空白组的3.08倍(P＜0.01);是阴性对照组的2.69倍(P＜0.01),均有显著性差异.结论:通过RNA干扰沉默宫颈癌Hela细胞Survivin基因能够促进细胞凋亡的发生,Survivin可能成为基因治疗宫颈癌的理想靶基因.     

姜黄素对人宫颈癌Caski细胞裸鼠移植瘤MIF和VEGF-C表达的影响

目的 探讨姜黄素对人宫颈癌Caski细胞裸鼠移植瘤巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)VEGF-C表达的影响,以探讨其抗肿瘤机制.方法 建立裸鼠人宫颈癌Caski细胞移植瘤动物模型,成瘤后动物模型随机分为5组,每组7只:阴性对照组、顺铂组(3 mg· kg-1· d-)和3个姜黄素组(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200mg· kg-1 ·d-1).实验结束后处死各组裸鼠,剥取瘤体并称重,同时寻找淋巴转移灶.应用RT-PCR和免疫组化法检测瘤组织中MIF、VEGF-C mRNA及蛋白的表达.结果 1)RT-PCR结果显示3个姜黄素组(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)及顺铂组瘤组织中MIF、VEGF-C mRNA的相对表达量较阴性对照组显著减少(P＜0.05);MIF mRNA在姜黄素50 mg· kg-1·d-1组的表达与姜黄素100 mg·kg-1·d-1组、姜黄素200 mg·kg-1·d-1组的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05),与顺铂组表达比较差异有统计学意义(P＜0.05);VEGF-C mRNA在姜黄素50mg·kg-1·d-组的表达与姜黄素100 mg·kg-1·d-1组、姜黄素200 mg·kg-1·d-1组及顺铂组表达比较差异有统计学意义(P＜0.05);2)免疫组化统计结果显示:3个姜黄素组(50 mg·kg-1·d-1、100mg·kg-1·d-1、200 mg· kg-1·d-1)及顺铂组瘤组织中VEGF-C、MIF蛋白表达明显低于阴性对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 姜黄素可能是通过降低人宫颈癌Caski细胞裸鼠移植瘤中MIF、VEGF-C的表达发挥抗宫颈癌淋巴转移作用.     

RNA干扰沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

[目的]通过小于扰RNA（siRNA）沉默EGFR基因的表达，探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力的影响。[方法]体外构建靶向EGFR基因的siRNA质粒和阴性对照质粒，Lipofectamine2000介导转染到SKOV3细胞中。实验分3组：空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组。RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因和蛋白水平表达。平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力，Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力。[结果]特异性转染组细胞EGFR基因mRNA和蛋白表达的抑制率分别为52．3％和51．8％．克隆形成抑制率和侵袭抑制率分别为47．4％和40．1％。[结论]siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达，抑制其增殖能力和体外侵袭能力。     

RNAi抑制STAT3基因表达对人宫颈癌SiHa细胞化疗敏感性的影响

目的:探讨信号转导因子与转录激活因子3(STAT3)短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞化疗敏感性的作用.方法:构建STAT3基因shRNA真核表达质粒并转染宫颈癌SiHa细胞,RT-PCR及免疫蛋白印迹分别检测STAT3基因的mRNA及蛋白表达水平.细胞经不同浓度顺铂(DDP)作用后,流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞生长抑制率并计算DDP的50%抑制浓度(IC50).结果:与各对照组细胞相比,转染STAT3基因shRNA真核表达载体的SiHa细胞,STAT3基因在mRNA和蛋白水平表达均下降,凋亡率均明显增加,细胞对DDP的IC50值明显下降,差异均有统计学意义.结论:针对STAT3基因的shRNA真核表达载体有效地抑制宫颈癌SiHa细胞STAT3基因表达,增强其对化疗药物DDP的敏感性.     

HPV18E6基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响

目的：观察RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达对宫颈癌Hela细胞牛长和凋亡的影响，探索宫颈癌基因治疗的新途径。方法：针对HPV18E6 mRNA序列合成一对60bp的编码siRNA的DNA模板和一对60bp的非特异性对照DNA模板，构建pSUPER—siRNA和pSUPER—com重组质粒，瞬时转染Hela细胞；采用RT—PCR法检测质粒转染后细胞HPV18E6基因表达的变化，用蛋白免疫印迹法检测转染后Hela细胞p53、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达变化，以细胞计数法检测细胞生长情况，Hoechest／PI双荧光活细胞染色法检测细胞凋亡。结果：pSUPER—siRNA质粒转染能有效降低HPV18E6在mRNA水平的表达，转染后48小时，抑制效率达70％以上；转染后细胞053、p21和Bax蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达减少。RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达后，Hela细胞增殖受到明显抑制，细胞凋亡率明显增加。结论：pSUPER—siRNA质粒转染可有效抑制HPV18E6在人宫颈癌Hela细胞中的表达，抑制Hela细胞生长并促进其凋亡。以HPV18E6为靶点的RNA干扰技术可望成为宫颈癌基因治疗的新途径。     

RNA干扰技术抑制宫颈癌细胞低氧诱导因子-1表达的研究

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,使用特异的靶向作用HIF-1基因的小干扰RNA(siRNA)作用于宫颈癌细胞株SiHa,以了解siRNA对HIF-1基因的特异性抑制作用.方法:设计合成针对HIF-1的四个siRNA,鉴定无误后均借助脂质体转染宫颈癌细胞株SiHa.检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中mRNA和蛋白的表达变化.筛选出抑制率最高的siRNA.用筛选出的siRNA转染SiHa细胞,检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中不同时间点mRNA和蛋白的表达变化,验证RNAi作用的特异性及时效性.结果:H2siRNA引起常氧和低氧培养的SiHa细胞中HIF-1基因表达水平的下降最显著(P<0.05);将H2siRNA转染常氧和低氧培养的SiHa细胞,转染后24、48、72及96h均可观察到HIF-1基因的显著降低,均以48h时靶基因表达水平的下降最显著(P<0.05),对应的非靶基因无明显抑制作用.结论:针对HIF-1构建的四个siRNA对HIF-1基因的干扰效率不同.本实验中,常氧及低氧培养SiHa细胞均以H2siRNA对HIF-1表达水平的降低作用最明显.将H2siRNA作用于SiHa细胞,可引起靶基因特异、高效性抑制,常氧及低氧条件下至少维持到转染后96h,且均以48h时基因表达水平的下降最显著.在SiHa细胞株,HIF-1 siRNA通过下调HIF-1发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用,RNAi技术可望为宫颈癌提供一种新的特异性基因治疗方法.     

Effects on Proliferation and Migration of the Human Colon Carcinoma Cell Line SW620 by Silencing of Hepatocyte Growth Factor Expression

OBJECTIVE Hepatocyte growth factor (HGF) expression is closely related to the progression and poor prognosis of colorectal cancer patients. In this study, we investigated the effects on proliferation and migration of the human colon carcinoma cell line SW620 by silencing HGF expression. METHODS HGF was silenced using specifi c HGF α/β siRNA.The proliferation, migration, cell cycle and ultrastructure of SW620 cells were examined. RESULTS The transfection efficiency was 70%–80%. The expression rate of HGF in the experimental group was signifi cantly lower than that in the negative and blank control groups (P <0.05). The proliferation inhibition rate in the experimental group at 24, 48, 72 and 96 h after transfection was 14.2%, 50.2%, 39.5% and 23.2%, respectively. The migratory ability of cells in the experimental group was significantly inhibited compared with that in the negative control or blank control groups (58.2% vs. 2.1% or 0%, P < 0.05).CONCLUSION The application of RNA interference to silence the expression of HGF in the colon carcinoma cell line SW620 effectively inhibits the proliferation and migration of tumor cells.     

Silencing of PDK1 Gene Expression by RNA Interference Suppresses Growth of Esophageal Cancer

The current study was conducted to explore the inhibitory effects of a small interfering RNA (siRNA) on3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) expression in esophageal cancer 9706 (EC9706) cells andthe influence on their biological behavior. After transfection of a synthesized PDK1 siRNA, PDK1 mRNA andprotein expression and the phosphorylation level of the downstream Akt protein were assessed using RT-PCRand Western blot analysis. Proliferation, apoptosis, cell invasion and in vivo tumor formation capacity werealso investigated using MTT, flow cytometry, Transwell invasion trials, and nude mouse tumor transplantion,respectively. PDK1 siRNA effectively suppressed PDK1 mRNA and protein expression, and down-regulated thephosphorylation level of the Akt protein in the EC9706 cells (P < 0.05). It also inhibited cell proliferation andinvasion, and promoted apoptosis; such effects were particularly obvious at 48 h and 72 h after transfection (P< 0.05). Growth of transplanted tumors was inhibited in nude mice, with decreased PDK1 expression in tumortissues. PDK1 may be closely correlated with proliferation, apoptosis and invasion of esophageal cancer cellsand thus may serve as an effective target for gene therapy.     

Silencing of Lysyl Oxidase Gene Expression by RNA Interference Suppresses Metastasis of Breast Cancer

Objective: The aim of this study was to investigate possible mechanisms of LOX gene effects on invasion andmetastasis of breast cancer cells by RNA interference. Methods: LOX-RNAi-LV was designed, synthesized, andthen transfected into a breast cancer cell line (MDA-MB-231). Expression of LOX, MMP-2 and MMP-9 wasdetermined by real-time PCR, and protein expression of LOX by Western blotting. Cell migration and invasivenesswere assessed with Transwell chambers. A total of 111 cases of breast cancer tissues, cancer-adjacent normalbreast tissues, and 20 cases of benign lesion tissues were assessed by immunohistochemistry. Results: Expressionof LOX mRNA and protein was suppressed, and the expression of MMP-2 and MMP-9 was significantly lowerin the RNAi group than the control group (P<0.05), after LOX-RNAi-LV was transfection into MDA-MB-231cells. Migration and invasion abilities were obviously inhibited. The expression of LOX protein in breast cancer,cancer-adjacent normal breast tissues and benign breast tumor were 48.6% (54/111), 26.1% (29/111), 20.0% (4/20),respectively, associations being noted with clinical stage, lymph node metastasis, tumor size and ER, PR, HER2,but not age. LOX protein was positively correlated with MMP-2 and MMP-9. Conclusion: LOX displayed animportant role in invasion and metastasis of breast cancer by regulating MMP-2 and MMP-9 expression whichprobably exerted synergistic effects on the extracellular matrix (ECM).     

RNA干扰诱导DNA修复基因hMGMT表达沉寂的研究

背景与目的：构建能特异诱导人DNA修复基因hMGMT表达沉寂的RNA干扰载体。材料与方法：通过两步法聚合酶链反应（Polymerasing chain reaction,PCR）扩增hMGMT特异RNA干扰表达盒,连入质粒载体构建RNA干扰质粒pU6-MGMTi,与pGEFP-C1共转染人支气管上皮16HBE（Human bronchial epithelial）细胞,G418筛选后,采用RT-PCR和Westem Blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达抑制情况。结果：成功构建hMGMT特异RNA干扰质粒pU6-MGMTi,转染16HBE细胞的mRNA和蛋白表达受到显著的抑制。结论：应用RNA干扰表达盒以及共转染技术,构建MGMT基因表达沉寂的细胞株,为进一步阐明MGMT基因的功能创造条件。     

溶瘤腺病毒介导RNA干扰人端粒酶逆转录酶抑制HeLa细胞生长

目的观察表达人端粒酶逆转录酶siRNA（hTERT-siRNA）的溶瘤腺病毒ZD55-TERT-siRNA对体外培养人宫颈癌HeLa细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法以溶瘤腺病毒ZD55-EGFP、表达hTERT-siRNA 的增殖缺陷腺病毒AD-TERT-siRNA和增殖缺陷腺病毒AD-EGFP作为对照组。不同滴度四种病毒分别感染HeLa细胞,结晶紫法检测细胞毒作用,MTT法测定细胞生长抑制率; RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学（ICC）法分别检测hTERT 的mRNA、蛋白质及抗原表达,Western blot和ICC法分别测定腺病毒E1A蛋白及抗原表达。结果对HeLa细胞的生长抑制作用和细胞毒作用ZD55-TERT-siRNA＞AD-TERT-siRNA和ZD55-EGFP＞AD-EGFP;ZD55-TERT-siRNA和ZD55-EGFP感染的HeLa细胞表达E1A;抑制hTERT表达作用依次为ZD55-TERT-siRNA＞AD-TERT-siRNA＞ZD55-EGFP、AD-EGFP。结论溶瘤腺病毒介导RNA干扰hTERT能有效抑制HeLa细胞生长及hTERT基因表达。     

RNA干扰c-Met基因表达对非小细胞肺癌侵袭和迁移及顺铂敏感性的影响

[目的]研究c-Met基因干扰后对肺癌细胞株95D侵袭、迁移能力和化疗药物敏感性的影响。[方法]分别采用免疫组化SP法和WesternBlot技术检测肺癌组织及不同肺癌细胞株中Met蛋白的表达情况。将c-MetshRNA质粒转染人肺癌细胞株95D．通过WestemBlot检测转染效率;Transwell小室和划痕愈合实验测定细胞体外侵袭和迁移能力：四甲基偶氮唑法（Mar法）检测细胞的增殖情况及顺铂敏感性。[结果]Met蛋白在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁正常组织,同时高侵袭性的肺癌细胞株（95D、801D）中Met蛋白的表达也较高。c-Met基因干扰能明显降低95D细胞的侵袭和迁移能力,并显著提高其对顺铂的敏感性。[结论]c-Met基因可作为一个重要的靶点应用于非小细胞肺癌治疗。     

RNA干扰抑制胃癌SGC-7901细胞中Livin基因的表达

背景与目的： 利用RNA干扰(RNAi)技术在体外抑制Livin基因表达,探讨RNA干扰用于胃癌治疗的可行性。 材料与方法： 设计靶向Livin基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),构建重组表达质粒pTZU6＋1-siRNA-Livin,并导入SGC-7901细胞,在体外诱导RNA干扰。并分别采用流式细胞术检测细胞周期变化,RT-PCR和免疫化学技术检测Livin基因表达,末端标记细胞凋亡法(TUNEL)检测细胞凋亡。 结果： 重组质粒pTZU6＋1-siRNA-Livin导入SGC-7901细胞株后,细胞S期比例由对照组的42.78％降低至19.15％(P<0.05), G1/G0期细胞由对照组的52.68％增至72.98％(P<0.05);pL1-siRNA质粒处理组细胞的Livin mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05),并出现明显的诱导细胞凋亡。 结论： RNA干扰可抑制SGC-7901细胞靶基因Livin的表达及细胞增殖,并诱导细胞凋亡,为胃癌的基因治疗提供了新思路。