表现神经症状的SIVmac251感染猴大脑基底节病毒gp120序列变异分析

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac251在中国恒河猴感染传代过程中产生的可能的神经侵袭性和神经嗜性及其分子机制。方法从静脉感染SIVmac251-155p6N的8只实验猴中出现严重神经症状的1只猴中,监测病毒及免疫指标变化,观察临床症状、猴脑组织病变,单拷贝PCR扩增病毒gp120序列并分析变异及糖基化位点变化情况。结果感染猴晚期出现明显艾滋病脑病症状,病理切片显示脑组织出现多核巨细胞及神经元变性、坏死。脑基底节分离出单一序列病毒,其氨基酸序列与血浆病毒及感染毒株SIVmac251-155p6序列差异主要位于Gp120的V1和V4区,并且在C1区66位出现一个糖基化位点缺失。结论SIVmac251在猴体长期传代过程中表现出神经嗜性毒株的特征,对AIDS脑病研究具有重要意义。      

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV／恒河猴模型，掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态，为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考，我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、sTLV、SRV／D和B病毒感染的恒河猴，用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴，使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法，监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况，持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况，IFN—YELISPOT结果和CD4＋T细胞数无相关性，与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围，了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系，完善了SIV／SAIDS模型评价指标，为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。     

HIV-1广谱中和活性样本膜蛋白基因序列特征分析

目的分析广谱中和活性感染者不同时间点HIV-1膜蛋白基因的序列特征。方法应用单拷贝基因组扩增技术(Single genome amplification,SGA)扩增获得不同时间点样本的全长膜蛋白(Env)基因,分析Env基因可变区序列长度、糖基化位点数目、细胞嗜性及中和表位关键氨基酸的变异。结果系统进化分析显示在5个不同时间点获得的98条全长Env基因为HIV-1 B’亚型毒株;毒株序列随时间推移基因距离增加,V1V2区序列长度变化大于V4区,V3区与V5区序列长度保持恒定;Env基因共享序列有27个潜在糖基化位点(PNGS),V1V2区的糖基化位点数目变化较大,MPER区次之,V3区数目恒定;部分毒株嗜性随时间推移发生了从CCR5到CXCR4的转变;Env基因与广谱中和活性相关的特征氨基酸位点的突变率在4.76%~100.00%间。结论广谱中和活性感染者不同时间点的Env基因序列差异随时间推移而增加,中和单抗识别的关键位点氨基酸存在不同类型和不同程度的突变,表明广谱中和活性感染者体内毒株在免疫压力下持续进化。     

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现,并比较由感染途径不同导致的差异,为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴,经直肠感染6只中国恒河猴,观察至感染后232或168d,比较其抗猴免疫缺陷病毒(SIV)特异性抗体滴度、CD4 T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴,感染后10d检测到SIV特异的IgM,而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d,静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内,直肠感染组的CD4 T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10~14d达到高峰(107拷贝/ml左右),约2个月后降至平台期(103~106拷贝/ml)。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150~210d死于猴免疫缺陷综合征,呈快速进展型改变。结论SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴,均可建立慢性的SIV感染,其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似,均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的动物模型,尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。     

猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

目的初步明确猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）耐9-（2-磷酸甲氧丙基）腺嘌呤（PMPA）突变基因位点,指导SIV／恒河猴模型在药物评价中的应用。方法SlVmae239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4^＋T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4^＋T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M5021可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV／恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。     

SHIV_(SF162P3)中国恒河猴细胞适应株的制备和鉴定

目的体外制备SHIVSF162P3中国恒河猴细胞适应株,建立病毒库,为模型制备提供生物学特性稳定的感染用病毒。方法用SHIVSF162P3体外感染中国恒河猴外周血单个核细胞(PBMCs),定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。利用病毒RNAenv区(M33262,6846bp～8481bp,共1636bp)序列分析的方法分析毒株在制备过程中的变异情况。静脉途径感染中国恒河猴G0801V,观察血浆病毒载量、外周血CD4+/CD8的变化情况。结果本研究共制备了275mLSHIVSF162P3病毒,病毒载量为4.389×107copies/mL,P24抗原水平为5.64×102pg/mL,TZM-bl细胞滴定TCID50为8.37×104/mL。gp120序列测定分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。感染猴G0801V高峰期病毒载量超过1×108copies/mL,急性期CD4+/CD8+倒置。结论此次制备的SHIVSF162P3细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIVSF162P3/中国恒河猴模型。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期(5年)的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴(G0401V→G0402V→0403V),同时,剔除G0401V猴CD8+T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴(G0401V→G0404V),应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4+T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8+T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的 体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性.方法 用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常中国恒河猴PBMCs共培养.定期测定培养液中的P24抗原水平.当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存.测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50.静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性.结果 本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变.病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL.1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上.结论 此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型.     

2000-2009年H1N1甲型流感病毒神经氨酸酶的进化分析和序列解析

目的研究2000-2009年世界各地不同物种流感病毒神经氨酸酶的进化特征和关键位点的变异情况。结论从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其氨基酸序列进行种系发生树的构建,以及序列特性的分析。结果新型流感病毒和猪/禽流感病毒NA蛋白在进化关系上非常接近,并且抗原决定簇和糖基化位点的变异也大致相同。结论新型毒株NA蛋白可能由早期的H1N1猪/禽流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致NA蛋白发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。     

猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重组和突变克隆的转染研究

目的　研究猴免疫缺陷病毒 (SIV)外膜糖蛋白 (envGP)基因片段与病毒复制功能的关系。方法　利用两病毒株共有的内切酶位点 ,将非致病性SIVmac142株envGP区的DNA片段与致病性SIVmac 2 39株的对应区域进行置换 ,构成多个重组体。RFLP和部分序列测序确定后 ,用等量突变病毒 (3μg)转染CD4+ T淋巴细胞CEM× 174细胞系 ,用ELISA监测培养液中SIV核心蛋白P2 7水平的变化 ,以判定重组病毒的复制能力。结果　与SIVmac 2 39株相比 ,SIVmac 2 39envGP重组体 (SIVmac 142 / 2 39envGP/142 )仍保持高度的复制活性 ,SIVmac 2 39gp41(…     

SIVmac239感染恒河猴急性期回肠派氏淋巴结中淋巴细胞亚群的变化

目的分析SIVmac239感染早期中国恒河猴回肠派氏淋巴结淋巴细胞数量及亚群的变化,探讨这些变化与疾病进展的可能关系。方法以静脉注射SIVmac239制备恒河猴AIDS模型,对回肠派氏淋巴结进行CD4和CD8免疫组化标记,分离Peyer’s集合淋巴结淋巴细胞,分别标记CD3、CD4、CD8、CD28、CD95单克隆抗体,以流式细胞仪检测T细胞及其亚群的表达情况。结果 SIVmac239感染急性期中国恒河猴Peyer淋巴结中CD4+/CD8+比值持续下降,记忆性细胞比例升高,但Peyer淋巴结形态及CD4+T细胞数量未见明显变化,CD8+T细胞从第5天开始持续升高。结论 SIVmac239感染急性期,中国恒河猴回肠派氏淋巴结形态及CD4+T细胞数量基本维持,向记忆性细胞的转化增加,但是CD4+/CD8+比值下降。     

恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性及其对蛋白结构和功能的影响

目的：筛查恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性（ coding-region single nucleotide polymorphism, cSNP）,研究其对蛋白结构和功能的影响。方法提取恒河猴外周血RNA,RT-PCR扩增,单克隆测序比对,确定猴BST-2的cSNP位点;通过蛋白质结构分析软件对蛋白结构进行分析;比较不同基因型猴体内SHIVSF162 p3复制水平的差异。结果序列比对发现8个非同义突变位点;经Psipred软件预测,其中G41A、T128C、C129和A333C cSNP位点可影响BST-2蛋白二级结构。在SHIVSF162 p 3感染平台期,参考基因型猴（ DLQ）病毒复制水平要高于GLQ型猴（P ＜0.05）,其他基因型猴之间无显著差异。结论 cSNP （G41A）可能影响BST-2的抗病毒功能,这为后续研究提供参考信息。     

恒河猴P21基因在COS-7细胞中沉默位点的验证

【摘要】 目的 在细胞水平筛选恒河猴 p21基因的有效沉默靶点。方法 检测 COS-7 中 p21基因的表达水平;设计shRNA并构建p21-RNA干扰慢病毒载体FUGW-TDT-p21shRNA转染 COS-7 细胞,通过real-time PCR检测沉默效率,并以 Western Blot 在蛋白水平进行验证。结果 筛选到四个有效的靶位,分别位于p21 mRNA 的541-561bp,542-562bp,215-239bp,624-648bp。四个靶位点在mRNA水平的沉默效率分别为 (91.82?.21)%, (82.47?.48)%, (81.31?.69)%和(87.35?.59)%。相应的蛋白表达量为(11.97?.70)%, (20.22?.65)%, (23.21?.63)%和(14.42?.86)%。结论 在细胞水平筛选得到四个有效的 p21基因沉默靶点,可用于恒河猴基因沉默研究。     

SIVmac239病毒经不同途径感染恒河猴急性期CD4+T细胞数量与其细胞表面CD95表达量的变化关系

目的研究SIVmac239病毒分别通过直肠(rectal infection:IR)及静脉(intravenous infection:IV)感染恒河猴,在感染急性期外周血CD4+T细胞数量与其细胞表面的死亡受体(CD95)表达量之间的变化关系。方法将SIVmac239经直肠及静脉途径各感染14只恒河猴。监测病毒载量、CD4+T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比值的变化,从而明确感染。同时,在感染急性期内9个时间点采集静脉血,并利用流式细胞术分析CD4+T细胞表面CD95的表达量。结果静脉组恒河猴CD95表达量于第2天开始升高,第7天达到最高,同时CD4+T淋巴细胞数降到最低。直肠组恒河猴也于感染后第2天开始升高,但第10天才达到最高值,CD4+T淋巴细胞数于第17天降到最低。同静脉组相比,直肠组CD95表达量增高及CD4+T细胞数降低均较晚出现,且其CD4+T细胞数量降至最低晚于CD95表达量达到峰值一周后出现。结论 SIVmac239经直肠及静脉感染恒河猴后,伴随CD4+T细胞表面CD95表达的升高,CD4+T细胞数量逐渐下降。但不同感染途径对CD4+T细胞表面CD95的表达量与CD4+T淋巴细胞数的变化不尽相同,这可能由于不同感染途径造成CD95在感染急性期CD4+T细胞数量降低中发挥的作用不同。     

猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直肠暴露对机体细胞免疫的影响

目的研究猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直肠粘膜暴露对机体细胞免疫的影响。方法建立小剂量多次直肠粘膜暴露模型,测定实验猴的血浆病毒载量了解病毒复制水平,测定外周CD4+T细胞绝对数了解疾病进展情况,测定T细胞亚群和外周单个核细胞IFN-γ分泌情况了解机体细胞免疫状况。结果小剂量SIVmac239病毒多次暴露能导致病毒通过直肠粘膜进入动物体内,诱导机体免疫系统出现变化,但未见SIVmac239典型感染。病毒多次直肠暴露诱导出特异性细胞免疫,但与普通病毒感染相比,水平较低。结论本研究明确了猴免疫缺陷病毒小剂量暴露对机体细胞免疫的作用,为HIV疫苗研究提供了基础信息。     

两株SIV_(mac)的滴定和特性

SIVmac251的MID100为32TCID，而SIVmac239的MID100高于320TCID。体内滴定感染成功的5只猴（SIVmac2513只，SIVmac2392只）和用ZMID100SIVmac251感染的7只猴感染后有全身淋巴结肿大，并出现规律性的血浆病毒血症和抗体反应。SIVmac251感染的7只恒河猴和2只食蟹猴的淋巴结和脾脏的病理组织学检查，显现规律的SIVmac感染后的组织学变化。上述结果表明两株SIVmac均能诱发SIVmac感染猴的系列表现和变化，可应用于抗艾滋病药物猴体疗效的评价。     

灵芝制剂治疗猴获得性免疫缺陷综合征的疗效观察

目的 初步观察灵芝制剂治疗猴获得性免疫缺陷综合征(SAIDS)的疗效.方法 以5只成年雌性中国恒河猴为研究对象,经直肠感染猴免疫缺陷病毒(SIV)SIVmac239株,17个月后经实验室检查证实SAIDS造模成功.给予其中3只每日口服1次灵芝制剂,共8个月,整个实验时间为1年.对照组2只猴不服药.结果 治疗组猴#393,对照猴#361、#348分别死于实验开始后3.5、6、11个月,尸检显示为艾滋病后期和机会性感染,治疗组猴#374和#381存活至实验结束.治疗组猴#374的外周血CD4+T淋巴细胞在治疗后6个月较治疗前上升30%,其后有些波动.治疗组猴的血浆病毒载量在治疗过程中逐渐下降达1 log10,对照组猴的病毒载量没有下降.病理检查结果显示,治疗组猴出现淋巴组织免疫重建、胸腺再生、海马回神经细胞新生,脑垂体、松果体、甲状腺、肾上腺和卵巢等内分泌器官在形态学上均恢复趋向常态;对照组猴则表现为淋巴结耗竭、脾脏萎缩、胸腺消失,内分泌器官处于高-中度萎缩,甚至衰竭状态.结论 灵芝制剂可能对SAIDS猴的免疫、神经和内分泌系统具有一定的保护作用.     

昆明地区恒河猴、食蟹猴种群繁殖规律和繁殖性能研究

目的探索昆明地区人工饲养恒河猴与食蟹猴种群的繁殖规律及繁殖性能,为恒河猴和食蟹猴繁育基地建设、生殖生物学研究及生物资源的保护提供数据参考。方法对昆明某规模化实验猕猴饲养基地饲养的150只恒河猴繁殖群(20只雄猴,130只雌猴)和900只食蟹猴繁殖群(120只雄猴,780只雌猴)全年12个月的繁殖规律及繁殖性能进行观察和统计分析。结果昆明地区恒河猴种群产仔具有明显的季节性变化,而食蟹猴种群产仔没有明显的季节性变化;恒河猴种群的妊娠率、繁殖率、仔猴成活率分别是76.15%、69.23%和90.70%;食蟹猴种群的妊娠率、繁殖率、仔猴成活率分别是78.98%、74.87%和94.81%;恒河猴的月经周期和妊娠期分别是(28.80±2.33)d和(165.87±7.52)d;食蟹猴的月经周期和妊娠期分别是(29.35±3.05)d和(157.93±5.42)d;恒河猴仔猴平均出生体重和幼猴平均断奶体重分别是(425.00±100.50)g和(1491.67±172.35)g;食蟹猴仔猴平均出生体重和幼猴平均断奶体重分别是(314.33±61.18)g和(1013.50±115.50)g。结论明确了昆明地区恒河猴和食蟹猴种群的繁殖规律,详实地报道了恒河猴和食蟹猴种群繁殖性能参考值,为昆明地区恒河猴和食蟹猴的繁殖及开展实验猴生殖生物学的科研活动提供了基础数据。     

恒河猴婴猴离乳阶段行为观察及分析

目的了解婴猴离乳期的行为特点及规律,初步探讨婴猴早期断奶后心理和行为的变化。方法采用随意取样和时间记录法对2012年出生的290只婴猴离乳后的行为进行6个月的观察记录。结果离乳后1个月内出现团抱、吸手指、吸同伴身体3种行为,团抱、吸手指行为在第2、3月显著上升(P0.05),吸同伴身体行为在第2月显著上升(P0.05);第2个月,新增的踱步、吸生殖器的行为于第3个月显著上升(P0.05),爬跨行为随时间的延长无明显变化;第3个月新增吸脚趾行为的比例未随时间的变化而发生改变。其中,雌性同笼发生团抱的比率显著高于异性及雄性同笼(P0.05);雄性婴猴较雌性婴猴更易发生踱步行为;雄性婴猴吸手指及吸同伴身体的行为发生率显著低于雌性(P0.05);吸脚趾行为雌、雄发生率无显著差异。结论通过观察婴猴离乳后的行为,观察到团抱、踱步、吸脚趾、吸手指、吸生殖器、吸同伴身体和爬跨7种行为,且各行为均随时间的变化而递增。团抱行为反映了恐惧心理;吮吸行为代表了生理需求及防卫心理;踱步行为初期是无目的,逐渐变成焦虑心理的体现。为研究人类婴幼儿早期断奶后心理和行为的变化,开展心理学、行为学等方面的评估实验提供研究思路和模型。