肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论：RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景:脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的:拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法:采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论:RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

人WAF1基因的克隆及其生物调控作用

目的 克隆人WAF1基因,构建成WAF1－pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能。方法 采用RT－PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因,cyclinD1基因的调控作用。结果 从Hela细胞扩增的从WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1－pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1／CIP1的Hcl-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb,抑制cyclinD1蛋白表达的调控作用。结论 成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1－pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应。     

pcDNA3.1-HPV18E7重组基因的克隆

目的 从HPV18感染细胞中提取HPV18E7 DNA,构建pcDNA3．1-HPV18E7重组质粒。方法 应用PCR方法从HPV18感染细胞中扩增HPV18E7 DNA,并应用基因重组技术构建pcDNA3．1-HPV18E7重组质粒。结果 PCR扩增产物经电泳检测及测序鉴定证实为HPV18E7;基因重组产物经PCR鉴定及测序证实为pcDNA3．1-HPV18E7,成功构建了pcDNA3．1-HPV18E7重组质粒。结论 从受感染人体细胞中成功扩增出HPV18E7,并成功构建pcDNA3．1-HPV18E7重组质粒,为HPV基因疫苗的构建和治疗HPV感染相关肿瘤奠定了基础。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的：克隆大鼠神经营养因子4全长基因，构建真核细胞表达质粒。 方法：实验于2004—06／2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠，用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板，应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中，构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。 结果：提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带，聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带，测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致（M86742），说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。 结论：正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的：体外扩增弓形体主要表面抗原SAG1基因,构建pcDNA3-SAG1真核表达质粒,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法：采用PCR技术,自行设计一对寡核酸引物（P1,P2）,从弓形体RH株基因组DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增的目的片段经纯化后用EcoR1和HindⅢ双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨苄青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子分别用Sac1单酶切、EcoR1和HindⅢ双酶切鉴定,结果成功地构建真核型表达质粒pcDNA3-SAG1,从而为进一步SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果：从RH株基因组DNA中特异扩增出编码SAG1的全基因序列,扩增目的基因片段大小与预期长度（1025bp),相符;将分离、纯化的目的基因片段SAG1任入pcDNA3质粒HindⅢt和EcoR1位点,构建重组质粒pcDNA3-SAG1。结论：成功构建重组质粒pcDNA3-SAG1。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用DcDNA4．0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于200703／2008—02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子B1的mRNA，反转录聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子B1，再亚克隆入载体pcDNA4．0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标：TGF-β1 cDNA、pGEM—T—TGF-β1和重组子pcDNA4．0-TGF—β1的表达。结果：经过反转录一聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM—T—TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4．0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的:克隆大鼠神经营养因子4全长基因,构建真核细胞表达质粒。方法:实验于2004-06/2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠,用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板,应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中,构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。结果:提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带,聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带,测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致(M86742),说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。结论:正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4。结果PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

自噬相关基因Beclin-1的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆并构建自噬相关基因Beclin-1原核表达载体.方法 根据Beclin-1编码区DNA序列设计引物,用前列腺癌细胞LNCaP作为模板进行RT-PCR,扩增Beclin-1编码区全基因片段,与pQE-80质粒连接后进行测序鉴定.结果 RT-PCR扩增出Beclin-1目的基因,限制性内切酶证实其已插入表达质粒中,DNA测序证实Beclin-1编码区全基因片段与GenBank公布的相应基因核苷酸序列的同源性为完全一致.结论 成功克隆并构建了自噬相关基因Beclin-1原核表达载体,为研究Beclin-1蛋白的细胞自噬作用奠定了基础.     

TCRγV1/pcDNA3重组质粒的构建

目的：构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒.方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamHⅠ与HindⅢ酶切位点TCRγV1基因序列,对pcDNA3载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5a,对重组质粒经序列测定,称pcDNA3/TCRγV1.结果：电泳获得333bp的TCRγV1预期条带.结论：该条带测序证实为TCRγV1基因序列.     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

目的从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出信号蛋白Sj14-3-3编码基因，并亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法提取日本血吸虫成虫总RNA，分离mRNA，RT-PCR法制备cDNA．并扩增出Sj-4-3-3编码基因，通过线性TA克隆载体pGEM-T连接，亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，经转染至COS-7细胞中表达，Western blotting鉴定。结果RT-PCR产物、pGEM-T-Sj14-3-3及pcDNA3．1( )-Sj14-3-3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段，经SDS-PAGE及Western blotting鉴定后的分子量为29kD。结论真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-Sj14-3-3在COS-7细胞中的表达产物是一分子量为29kD的蛋白，并能被抗Sj14-3-3单克隆抗体识别。     

大鼠脑源性神经营养因子基因重组真核表达载体的构建及其表达

背景：脑源性神经营养因子对多种神经元的发育、存活及轴突再生中起着重要作用，但由于血脑屏障的存在，限制了其应用。 目的：构建大鼠脑源性神经营养因子基因重组真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达。 设计、时间及地点：单一样本实验。于2005—09／2006—09在昆明医学院神经科学研究所完成。 材料：清洁级健康雄性8周龄SD大鼠，体质量250g。 方法：①以反转录聚合酶链反应从大鼠脑组织总RNA扩增脑源性神经营养因子基因编码序列，将其克隆到真核表达载体pcDNA3中，构建重组表达载体pcDNA3／BDNF。②将L939细胞分为pcDNA3／BDNF转染组、pcDNA3转染组和未转染组，以FuGeneHD转染试剂介导相应质粒转染。 主要观察指标：①重组质粒pcDNA3／BDNF的酶切鉴定与序列分析。②免疫细胞化学和western blot鉴定脑源性神经营养因子在L929细胞中的表达。 结果：①重组质粒pcDNA3／BDNF经酶切产生783bp和5．2kb的片段，DNA测序证实783 bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因编码序列完全一致。②基因转染后，免疫细胞化学、western blot结果表明脑源性神经营养因子能在真核细胞中正确表达。 结论：成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3／BDNF，为后续研究奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

背景:FasL通过与靶细胞上Fas结合诱导程序性细胞死亡,可维持机体内稳态,诱导同种异基因移植免疫耐受,促进肿瘤细胞凋亡.目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因hFasL的真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL.方法:通过实时聚合酶链反应RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出hFasL基因,与真核空载体 plRES2-EGFP一起,经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接,从而构建pIRES2-EGFP-hFasL.用紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度,经酶切、PCR技术、基因测序等方法进行鉴定.结果与结论:扩增出的hFasL条带大小约846 bp,构建的plRES2-EGFP-hFasL经酶切后在846 bp和2 000 bp处有特异性条带,DNA测序证实hFasL与Genebank上的序列完全一致.提示成功构建了含有hFasL及EGFP的真核表达载体plRES2-EGFP-hFasL.     

HBV preS2真核载体的构建及其表达

【目的】扩增乙型肝炎病毒（HBV）前S2基因（preS2）,并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础。【方法】从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBVDNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3．1（＋）上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）preS2,并将其转染巨噬细胞48h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达。【结果】从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3．1（＋）载体,得到HBVpreS2真核表达载体pcDNA3．1（＋）-pre2。【结论】成功地构建了舍preS2基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBVpreS2。