纤维支气管镜在结核病非人灵长类动物模型建立中的应用

目的:应用纤维支气管镜将结核分枝杆菌(MTB)接种猕猴肺部,建立结核病模型。方法:分别用不同菌量的MTBH37Rv株,Erdman株和临床耐药株、经纤维支气管镜接种实验猴右肺下叶,在规定的时间,观察其结核菌素皮肤试验和胸部X线表现、肺部病理学改变和肺组织细菌载量。结果:所有感染猕猴的结核菌素皮肤试验呈阳性,胸部X线呈现结核样改变,病理解剖显示肺部均有不同程度的病理变化;显微镜下肺组织中可见特征性的结核结节,肺组织中均培养出了数量不等的结核分枝杆菌。结论:经纤维支气管镜将一定量的结核分枝杆菌接种实验猕猴的右肺能成功建立结核病实验猴模型,该方法能为结核疫苗和药物疗效评价平台提供良好的技术支撑。     

非人灵长类动物模型低温治疗方法及在脑卒中模型中的应用进展

近年来由于缺血性脑卒中发病率、死亡率不断攀升,治疗性低温被认为最有前景的神经保护方法,而且低温对脑损伤的保护作用已被众多研究验证并且广泛用于转化研究,但是临床研究始终未发现明确的神经保护作用.局部脑缺血的大动物模型已成为基础科研与临床转化研究间的桥梁,在神经保护研究中具有不可替代的作用.本文总结了多种非人灵长类动物局部...     

生物材料在核酸疫苗中的应用

核酸疫苗具有很多传统疫苗不能比拟的优势,是现代疫苗研发的新热点。然而,与传统疫苗相比,裸露的核酸疫苗最大的缺陷是不能引发足够强的免疫应答。因此,科学家们利用生物材料作为核酸疫苗的载体,以颗粒或非颗粒的形式帮助它克服各种人体障碍进入细胞,并保护其活性,从而提高核酸疫苗的免疫应答强度和效率。设计高效、低毒的疫苗载体有众多因素需要考虑,如疫苗的制备方法和配方比例、生物材料与疫苗之间的相互作用、生物材料的化学和物理性能、材料的微观和宏观形态等。本文就以上因素进行概括总结,以使读者了解生物材料在核酸疫苗方面的研究现状。     

基因佐剂在核酸疫苗中的应用

基因佐剂是指将某些分子的基因,与核酸疫苗所编码的抗原基因共同应用于机体后,这些分子基因的表达产物(与抗原融合或非融合两种形式),可通过募集和活化淋巴细胞,促进疫苗编码抗原的摄取、加工和提呈,刺激协同刺激分子表达和细胞因子分泌等作用,调节疫苗编码抗原所诱导的免疫应答的大小和方向,提高核酸疫苗的效力.目前,应用于核酸疫苗的基因佐剂主要有以下几种:     

磷酸钙作为佐剂应用在乙肝核酸疫苗中的可能性研究

目的：研究使用磷酸钙作为乙ＤＮＡ疫苗的佐剂,诱导机体免疫反应的可能性,方法：磷酸钙与疫苗ＤＮＡ制备出磷酸钙－ＤＮＡ共沉物,免疫小鼠,检测外周血抗体,观察免疫应答反应,结果：磷酸钙－ＤＮＡ共沉物能激发机体免疫应答反应。结论：佐剂在核酸疫苗的应用值得进一步研究。     

人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建含人MUC－1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS－7细胞中的表达。方法 将目的基因MUC－1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pcDNA3.1( )，构建真核表达载体pcDNA3.1( )-MUC-1。用电穿孔法将重组质粒转入COS－7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC－1的表达。结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC－1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC－1基因能在COS－7细胞中表达。结论 人MUC－1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS－7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

hCTGF基因真核表达载体的构建及在HUVECs中的表达鉴定

目的 构建人结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体，并在哺乳类细胞人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中获得表达。从而为进一步研究CTGF基因在血管新生的作用打下基础。方法 根据人CTGF基因的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有Xba Ⅰ和HindⅢ酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法扩增JIVECs中CTGF，回收PCR产物，并将其连接至克隆载体PIM-18中，重组的PUMT-18在大肠杆茵DH5α内扩增后，经质粒提取、XbaⅠ和HinsⅢ酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有CTGFcDNA全长的酶切片段，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经XbaⅠ和HindⅢ酶切予以鉴定。并将其转染到HUVECs中，Western blotting法证实其表达。结果 RT-PCR产物含有CTGFcDNA，基因测序显示重组的PUMT-18中含有正确的人CTGFcDNA全长编码序列，重组的pcDNA3．1(-)含有人CTGFcDNA全长编码序列，Western blotting证实重组的真核表达载体在人脐静脉内皮细胞成功转染并表达。结论 成功构建人结缔组织生长因子CTGF基因的真核表达载体。     

GRP78核酸疫苗在非小细胞肺癌模型中的抗肿瘤作用研究

目的:研究GRP78核酸疫苗对非小细胞肺癌的预防作用及生存期影响。方法:将携带GRP78基因的真核表达载体肌肉内注射免疫C57BL/6小鼠,完成3次免疫后,接种小鼠非小细胞肺癌细胞(Tc-1),以此来观察该疫苗对非小细胞肺癌的预防作用及生存期影响。结果:免疫后的治疗组肿瘤生长体积小于对照组,平均生存期比对照组延长了25天,免疫细胞分泌细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的水平和对靶细胞的杀伤率明显高于对照组。结论:GRP78核酸疫苗能够提高机体免疫细胞对非小细胞肺癌的杀伤能力,延缓肿瘤生长,延长生存期。     

人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建含人cD81基因的真核表达载体，探讨CD81在COS-7细胞的表达，为研究丙型肝炎病毒(1-ICV)与cD81相互作用奠定基础．方法：从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81，应用双酶切回收基因片段，定向克隆入真核表达载体pVAX1；通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞；应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物．结果：重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确，并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白．结论：成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81，并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子，该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型．     

Aβ1-5多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果

目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗，研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段；在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列；GSGGSG linker再串连两段Aβ1-15二价基因片段，克隆入pcDNA3．1表达载体，构建peDNA3．1-s4xAβ15真核表达质粒；质粒转染COS-7细胞，Western blot检测4xAβ15的表达；质粒肌肉注射接种BALB／c鼠，共6次，18周加强免疫，ELISA法检测抗体效价以及抗体分型；免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合。【结果】测序证实所构建的peDNA3．1-s4xAβ15载体序列正确，在COS-7细胞中表达分子质量约8ku的分泌型4xAβ15蛋白。peDNA3．1-s4xAβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体，随加强免疫次数增多，抗体滴度增加，在19周，抗体平均滴度为1：6400，抗体以IgG1型为主，且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和。【结论】所构建的peDNA3．1-s4xAβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体，为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件。     

SARS-CoV基因疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的构建SARS病毒E、M、N基因疫苗,研究其免疫原性。方法通过PCR扩增获得SARS-CoVE、M、N基因片断,将其分别克隆入真核表达载体pVAX1,将所得真核表达质粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N分别肌肉注射小鼠和兔子,用ELISA法检测血清抗体,观察实验期间动物的体重变化,处死后对重要脏器进行病理检查。结果pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N基因测序结果与基因库中公布的一致。3种基因疫苗肌肉注射免疫小鼠和兔子后均能诱导产生特异性抗SARS-CoV抗体;动物一般状况和体重变化与对照组差异无显著性;重要脏器无明显病理改变。结论pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N疫苗能够诱导机体产生特异的体液免疫应答,具有较好的免疫原性和安全性,为SARS疫苗的研制奠定了良好基础。     

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体，探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响。方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3-Nox1，并将其转染NIH3T3细胞，采用RT-PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达，检测细胞活性氧和细胞活力。结果RT-PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA，细胞中的活性氧水平明显升高，同时对As2O3细胞毒作用更加敏感。结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3-Nox1转染细胞后可有效表达Nox1，使活性氧水平升高，并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性。     

VP22增强人巨细胞病毒pp65核酸疫苗在小鼠体内免疫活性的实验研究

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)主要被膜磷蛋白pp65(HCMVpp65)基因高表达载体以及VP22.pp65联合表达载体,并评价VP22增强pp65核酸疫苗的体内免疫效果。方法8周龄正常BALB/C雌性小鼠分为pcDNA3.pp65组、pVP22.pp65组、实验对照组,每组7只。利用分子克隆技术构建HCMVpp65表达载体pcDNA3.pp65、VP22与pp65融合基因载体pVP22.pp65,免疫小鼠,四甲基偶氮唑蓝法测定T淋巴细胞增殖反应、白细胞介素(IL)2生物学活性,乳酸脱氢酶释放法测定自然杀伤细胞(NK)活性,酶联免疫吸附实验测定血清HCMVIgM、IgG抗体含量、血清及脾细胞培养液中的IL2、IL4含量。结果小鼠的一般状况始终良好,成功构建了HCMV核酸疫苗载体pcDNA3.pp65、pVP22.pp65;免疫小鼠后,两种疫苗T淋巴细胞增殖反应(8周时刺激指数分别为5.11和5.55)和NK细胞活性(12周分别为8.74%和12.08%)及HCMVIgM(6周时A值分别为1.20和1.58)、IgG抗体(6周时A值分别为1.09和1.78)均高于对照组,且pVP22.pp65组高于pcDNA3.pp65组(P<0.05)。小鼠血清中IL2和IL4含量及IL2的生物学活性较低,各组间差异无统计学意义(均P>0.05);小鼠脾细胞上清中IL2和IL4含量以pVP22.pp65组(411.11pg/ml、76.10pg/ml)最高,IL2生物学活性也以pVP22.pp65组(A值为0.22)最高。结论HCMV核酸疫苗无毒性。pp65     

Omi/HtrA2 shRNA重组真核表达质粒的构建及其在大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧模型中的作用

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的Omi/HtrA2短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,观察其对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2表达的影响.方法 根据Genbank中Omi/HtrA2 mRNA分别设计2对多聚核苷酸序列,退火形成互补双链DNA,分别克隆至经双酶切后的载体Pgenesil-1上,构建Omi/HtrA2特异性的shRNA表达载体PGP1和PGP2,进行酶切和测序鉴定.制作NRK-52E缺氧/复氧模型,将表达质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,Westernblot检测Orni/HtrA2蛋白质表达.结果 将合成的DNA片段退火后克隆至Pgenesil-1载体上,构建Omi/HtrA2特异shRNA表达载体PGP1和PGP2;经酶切和测序证实构建成功,无碱基突变发生.将表达质粒介导转染NRK-52E缺氧/复氧模型后,细胞Chai/HtrA2蛋白质表达显著降低.结论 成功构建针对大鼠Omi/HtrA2基因的shRNA表达载体PGP1和PGP2,它们能有效抑制NRK-52E缺氧/复氧模型中Ckni/HtrA2表达.     

TERT、 PCNA和Bcl-2在实验性外伤性PVR视网膜前膜形成中的动态变化及相关性研究

目的 探讨与细胞增殖相关的端粒酶逆转录酶(TERT)、增殖细胞核抗原(PCNA)和凋亡抑制蛋白Bcl-2在外伤性增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)视网膜前膜形成中的动态变化及其相关性.方法 用S-P法对外伤性PVR大鼠模型视网膜前膜做端粒酶逆转录酶(TERT)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2免疫组织化学染色和HE染色,染色结果行图象分析.结果 伤后增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达阳性细胞率和平均光密度值出现先升高后降低的动态变化,14d组阳性率最高,与7d组和28d组比较差异有统计学意义.伤后TERT蛋白和Bcl-2表达阳性细胞率和平均光密度值出现先升高后稍降低的动态变化,14d组和21d组阳性率最高,与7d组比较有显著性差异,TERT、 PCNA和Bcl-2蛋白表达之间有显著相关性.结论 TERT、 Bcl-2参与外伤性PVR视网膜前膜增殖细胞的生长调控,与细胞增殖的动态变化呈高度相关性,为反义核酸技术等基因手段预防或治疗PVR以及治疗时间的选择提供实验依据.