腺病毒介导IκBα基因在体外培养U937细胞中的表达及效应研究

目的通过构建IκBα基因的腺病毒表达载体,并用急性相反应蛋白SAA3启动子来指导目的基因IκBα的表达,体外观察在炎性刺激后IκBα蛋白的诱导性表达特性及对NF-κB活性的调控作用,对炎症介质产生的抑制效应. 方法采用DNA重组与同源重组技术,构建含只响应病理信号的启动子-急性相反应蛋白启动子SAA3、目的基因IκBα的炎症诱导性复制缺陷型重组腺病毒载体(AdIκBα).应用AdIκBα,选择在炎症反应中具有代表意义的巨噬细胞,观察AdIκBα在体外培养巨噬细胞U937中诱导性表达IκBα (Western blot)、对NF-κB活性的调控(EMSA)及体外效应.结果①成功构建炎症诱导性IκBα表达质粒(pAdpLpl SAA3 NLS IκBα),该表达框含SAA3启动子,SV40大T抗原核定位信号(NLS),IκBα cDNA和ploy A; ② pAdpLpL SAA3 NLS IκBα质粒与pJM17同源重组,脂质体(DOTAP)介导,共转染入293细胞.PCR法筛选阳性克隆,获得重组腺病毒(Ad IκBα); ③用293细胞扩增Ad IκBα;采用反复冻融法纯化腺病毒,获得高滴度(5×1010 pfu/ml)重组腺病毒; ④体外实验,用50 MOI Ad IκBα预感染体外培养的U937细胞,再用LPS攻击后,该腺病毒诱导性表达IκBα蛋白(Western blot),且表达的IκBα能抑制NF-κB的活化(EMSA)、下调LPS攻击后TNF-α、IL-6的产生.结论该IκBα腺病毒表达载体通过调控NF-κB活性,可调控炎症介质(TNF-α、IL-6)的产生,用于调理细胞的炎症反应.     

SAA3启动子调控的炎症诱导表达系统体内表达及对内毒素响应特性研究

目的：探索应用血清淀粉样蛋白启动子（ＳＡＡ３）调控下游基因的可能性,利用构建的ＳＡＡ３ 启动子／氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）表达载体观察ＳＡＡ３ 启动子／增强子应用于调控目的基因体内表达特性及对体内炎症信号刺激的响应特性。方法：小鼠随机分２组,采用腹腔注射法转染脂质体／ＤＮＡ复合物,４８ ｈ 后ＬＰＳ攻击,测定ＬＰＳ攻击后不同时间ＣＡＴ的诱导表达（ＥＬＩＳＡ法）及不同时间的血清ＩＬ－６ 水平（ＥＬＩＳＡ法）。结果：ＬＰＳ攻击可诱导转染小鼠ＣＡＴ在肝、肺表达,ＬＰＳ活化迅速诱导肝脏ＣＡＴ表达,１２ ｈ 达３．７４ｎｇ／ｍｇ 蛋白,３６～４８ ｈ 维持较高的表达水平,９６ ｈ 下降;小鼠血清ＩＬ－６的水平与肝脏ＣＡＴ表达显著正相关ｒ＝ ０．８７。结论：本研究证实ＳＡＡ３ 启动子转录调控序列（－ ３０６～＋ ４７）在体内可响应炎症刺激灵敏启动、诱导下游的报告基因ＣＡＴ表达,适合于构建自适应炎症诱导性表达载体,为炎症疾病的基因治疗奠定基础及治疗新策略     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的：构建IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体，为研究细胞内IPl0的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法：采用基因重组技术构建含IPl0启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-IPl0；用脂质体瞬时转染HEK293细胞，观察IPl0启动子对脂多糖（LPS）刺激的反应。结果：酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的；该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低，经LPS刺激后，在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论：所构建的IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的，对生理相关刺激有很好的反应，可有效地用于IPl0基因表达信号调控机制的研究。     

维生素D3诱导U937细胞表达CD14蛋白的方法

目的探讨维生素D3诱导的U937细胞CD14蛋白表达的方法及其对内毒素刺激的反应性。方法用(0．1μMol)VitD3与U937细胞共同培养24h以诱导其表达CD14基因，使其产生CD14蛋白，并观察U937细胞对不同浓度LPS刺激不同时间后的反应。结果发现VitD3能稳定诱导U937细胞表达CD14mRNA基因和CD14蛋白，转型的U937／CD14细胞显著增加了对LPS刺激的敏感性，表现为低浓度LPS刺激能诱导其细胞核中NF-κ3B激活，指导TNF-a的mRNA的转录和表达，进一步合成和释放TNF-a。结论U937细胞是研究CD14在LPS介导MO激活的理想细胞模型，维生素D3能诱导U937细胞CD14基因和蛋白的表达，并增加其对内毒素刺激的反应性。     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

IFN-β基因启动子调控区域的分析及IRF-3报告基因的构建

目的对IRF-3的主要靶基因--小鼠IFN-β基因启动子区域进行分析并构建IRF-3报告基因载体.方法将小鼠IFN-β基因启动子全序列以及不同截短片段克隆到无启动子的pGF3basic/enhancer质粒中,以EGFP为报告基因,转染小鼠Raw264.7巨噬细胞系后观察细胞对LPS刺激的反应.结果IFN-β启动子PRD调控区域上游序列、PRDⅠ区,PRDⅡ区和PRDⅣ区缺失后,LPS同样能诱导EGFP报告基因的表达.只保留PRD区及IFN-β启动子核心区的载体转染Raw264.7细胞后,可以在LPS刺激下诱导EGFP报告基因的高表达.结论构建了能检测IRF-3活性的报告基因载体,为进一步研究LPS激活IRF-3的信号转导通路奠定了基础.     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

四环素调控的WT1基因表达系统在U937中的建立

目的：在白血病细胞系U937中建立四环素诱导的WT1基因表达系统。方法：运用脂质体将质粒pRevTet-On、pRevTRE-Luc和pRevTRE-WT1分别转染逆转录病毒的包装细胞PT67以产生逆转录病毒。将逆转录病毒RevTet-On感染U937细胞，经G418筛选，产生抗性细胞，用有限稀释法将U937/Tet-On抗性细胞单克隆化。14天后，克隆逐步形成，在显微镜下标记并移出。再将逆转录病毒RevTRE-Luc瞬时感染这些克隆，培养基中加入强力酶素(Dox)2mg/L或不加Dox，应用荧光素酶报告基因分析试剂盒检测荧光素酶的活性。挑选一株低背景和高诱导倍数的U937/Tet-On克隆，最后将逆转录病毒RevTRE-WT1感染这株克隆。结果：在U937中建立四环素调控的WT1基因表达系统。结论：建立逆转录病毒整合的U937细胞株，可用四环素及其衍生物精确调控WT1基因的表达，为研究WT1在白血病细胞系的功能提供一种有力的实验手段。     

肿瘤坏死因子诱导的U937细胞凋亡与Bcl-2基因表达的关系

目的 探讨肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）诱导的Ｕ９３７细胞凋亡与Ｂｃｌ－２基因表达的关系。方法 首先用ＴＮＦ处理Ｕ９３７细胞,提取小片段ＤＮＡ进行ＤＮＡ断裂分析,并通过ＲＴ－ＰＣＲ检测细胞的Ｂｃｌ－２基因ｍＲＮＡ表达,继而以磷酸钙沉淀法将Ｂｃｌ－２基因转染到Ｕ９３７细胞,用Ｇ４１８筛稳定转染子,然后用不同剂量ＴＮＦ处理后观察转染与未转染细胞的存活率。结果 ＴＮＦ诱导的Ｕ９３７细胞Ｂｃｌ－２基因的ｍＲＮＡ表     

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的探讨反义NHE1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响及其在肿瘤基因治疗中的价值.方法构建人NHE1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中, 从光镜、电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化.结果与亲本细胞相比,光镜下反义NHE1基因转染的SGC-7901细胞胞体增大,胞浆丰富,核大小相对一致,核浆比减少,核分裂相减少,异型性减小.透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,并可见髓鞘样变,粗面内质网、Golgi较发达,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强.结论反义NHE1基因转染能使SGC-7901细胞发生形态学及超微结构的变化,有促进SGC-7901细胞分化的作用.     

维甲酸和三氧化砷对急性早幼粒细胞性白血病细胞组织因子表 …

目的 探讨全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）和三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）在体内外对急性早幼粒细胞性白血病（ＡＰＬ）细胞组织因子（ＴＦ）表达的意义。方法 利用复钙时间测定、ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法,分别检测了ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３治疗前后ＡＰＬ患者（２３例）骨髓单个核细胞的促凝活性、ＴＦ抗原及其ｍＲＮＡ的转录水平,同时还检测了使用ＡＴＲＡ和Ａｓ２Ｏ３处理ＡＰＬ细胞株ＮＢ４－Ｒ１细胞以及转染ＰＭＬ－ＲＡＲａ融     

bcl-2基因过表达致急性髓系白血病对柔红霉素耐药机制的初步探讨

目的 探讨bcl-2基因过表达导致人急性髓系白血病对柔红霉素耐药的机制.方法 通过分子克隆技术构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,将其转染人急性髓系白血病U937细胞,分正常对照组、空载体对照组、转染组,与柔红霉素培养24 h,采用CCK-8法检测细胞增殖率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化,从而比较转染bcl-2基因前后,U937细胞对柔红霉素敏感性的变化.结果 成功构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,转染入U937细胞,PCR证实其转染效果;CCK-8法检测结果显示U937/ bcl-2组细胞存活率显著高于对照组和空载体对照组;bcl-2基因过表达降低caspase-3片段的裂解活化,降低U937细胞对柔红霉素的敏感性.结论 bcl-2过表达抑制caspase-3激活、抑制柔红霉素杀伤U937细胞,导致细胞对柔红霉素耐药.bcl-2可作为临床治疗急性髓系白血病的靶点.     

Toll样受体在金黄色葡萄球菌所致单核-巨噬细胞功能障碍中的作用

目的探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)在金黄色葡萄球菌所致单核-巨噬细胞功能障碍中的作用。方法利用小干扰RNA(siRNA)在单核-巨噬细胞中干预TLR2和TLR4的表达,同时设计无义序列作为对照。利用单核-巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除实验分析吞噬能力的变化。结果 siRNA-TLR2和siRNA-TLR4的相对表达率分别为45.2%和40.7%,显著低于无义序列的100.0%(P<0.05);金黄色葡萄球菌对siRNA-TLR2和siRNA-TLR4的U937细胞黏附率分别为50.2%和47.1%,与无义序列的100.0%比较差异有统计学意义(P<0.05);金黄色葡萄球菌在siRNA-TLR2和siRNA-TLR4的U937细胞中的清除率分别为46.3%和43.5%,与无义序列的100.0%比较差异有统计学意义(P<0.05);将金黄色葡萄球菌介质处理过的U937细胞的清除率设为100.0%,则金黄色葡萄球菌在TLR2抑制剂Pam3CSK4和TLR4抑制剂脂多糖处理过的U937细胞中的清除率分别为42.7%和40.6%,与无义序列的100.0%比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TLR2和TLR4的表达有利于单核-巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除。     

利用小干扰RNA表达框鉴定小鼠骨髓树突状细胞有效沉默RelB基因的实验研究

目的 构建靶向小鼠RelB基因的小干扰RNA（siRNA）表达框,鉴定针对小鼠骨髓树突状细胞（DC）的RelB基因最有效的siRNA序列。方法 利用PCR方法构建3个不同位点的表达框,R1／siRNA、R2／siRNA和R3／siRNA分别位于1027、302和1121位点。利用阳离子脂质体AdvantGene转染小鼠骨髓DC,转染24h后,脂多糖（LPS）刺激DC,用RT-PCR和免疫荧光方法检测DCReIB基因表达的变化。结果 经LPS刺激后DC成熟,RelB基因表达显著高于未成熟DC;R1／siRNA和R3／siRNA转染DC后,LPS刺激仍然可以增强RelB基因表达,而R2／siRNA转染DC后,LPS刺激不能增加RelB基因表达。结论 R2／siRNA可有效抑制RelB基因表达,有望用于构建新的耐受性DC应用于临床免疫耐受的诱导。     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响。方法通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87。实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞)。Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用。     

全仅式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)对APL细胞组织因子表达的影响

目的　探讨全反式维甲酸 (ATRA)和三氧化二砷 (As2 O3)在体内外对急性早幼粒细胞性白血病 (APL)细胞组织因子 (TF)表达的影响。方法　利用复钙时间测定、ELISA和RT PCR等方法 ,分别检测了ATRA和As2 O3 治疗前后APL患者骨髓单个核细胞的促凝活性、TF抗原及其mRNA的转录水平 ,同时还检测了使用ATRA和As2 O3 处理APL细胞株NB4细胞和NB4 R1细胞以及转染PML RARa融合基因的U937细胞的促凝活性、TF抗原及其mRNA的转录水平。结果　ATRA和As2 O3 在体内和体外均可以时间依赖的方式下调NB4细胞的促凝活性、TF抗原水平以及TFmRNA的转录。转染PML RARa融合基因的U937细胞与仅转染逆病毒载体的U937细胞相比 ,其TF表达水平显著升高 ;使用ATRA或As2 O3 分别处理转染PML RARa和转染逆病毒载体的U937细胞 ,其TF抗原水平均显著降低。结论　ATRA和As2 O3均可下调APL细胞TF的表达并降低其PCA ,As2 O3在诱导APL细胞凋亡的同时有可能通过下调APL细胞TF的表达而改善APL患者与DIC相关的出血症状。结果还提示APL细胞染色体易位产生的融合蛋白PML RARa可能对TF的异常表达有一定的影响 ,而ATRA和As2 O3对TF的下调作用可能不依赖于对融合蛋白PML RARa的降解。     

siRNA对骨肉瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖的抑制作用

目的: 研究siRNA对人骨肉瘤U20S细胞MDM2基因表达及肿瘤细胞增殖的抑制作用。 方法: 构建可表达针对MDM2的siRNA质粒(PGCsilencer^TM-MDM2-siRNA)。转染siRNA MDM2(简称siMDM2),阴性对照质粒到U20S,并设只加转染试剂作空白对照组,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting法检测siMDM2对MDM2基因和蛋白表达的抑制作用,并用MTT法检测siMDM2对细胞增殖的抑制作用。 结果: RT-PCR结果显示,转染siMDM2-1和 -2组MDM2的mRNA表达量分别下调到空白对照组的32.61%和39.06%;Western blotting结果显示,转染siMDM2-1和 -2组蛋白表达量下调到空白对照组的35.76%和42.20%;转染阴性对照质粒的MDM2基因和蛋白与转染试剂组比较差异均无显著性(P>0.05)。MTT结果显示,转染siMDM2后细胞生长受到明显抑制,与转染试剂组比较差异具有显著性(P<0.05),阴性对照组抑制率与转染试剂组比较差异无显著性(P>0.05)。结论：siRNA可以有效地抑制U20S细胞中MDM2的表达,并抑制细胞增殖。