甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的优化及应用

目的优化甲型流感病毒核酸提取步骤和RT-PCR反应液组成,提高RT-PCR荧光检测敏感性、缩短报告时间。方法优化QIAampViralRNAminiKit核酸提取操作步骤,对核酸裂解液处理后的样本进行两次层析柱过滤,核酸洗脱由试剂盒的室温环境改为72℃温育5min后离心洗脱,荧光RT-PCR反应液采用SuperScriptⅢPlatinumqRT-PCR系统优化,RT-PCR扩增程序修改如下:RT反应为50℃,10min,然后95℃,5min破坏逆转录酶,继后为45个循环的95℃,15s变性和60℃,30s复性和延伸。结果优化的甲型流感病毒核酸提取方法与QIAampViralRNA试剂盒方法获得的核酸Ct值基本一致,但低病毒含量样本的核酸提取效率明显高于未优化方法[优化方法Ct值(27.3,32.2,39.4),未优化方法Ct值(27.6,32.7,40.6)]。同一核酸在优化荧光RT-PCR扩增试剂的Ct值(25.0,30.5,35.6),扩增时间1h10min;明显优于配发试剂(27.3,32.5,40.1),扩增时间2h25min。结论优化后的甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法,无论是核酸提取还是荧光PCR扩增,其敏感性均明显得到提升,报告时间明显缩短。     

荧光定量PCR反应监测发热患者甲型H1N1流感病毒感染

目的通过荧光定量PCR反应监测发热患者甲型H1N1流感病毒感染情况,探讨该方法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法采用WHO推荐的荧光定量PCR方法对3361例发热患者咽拭子标本进行病毒核酸检测,确定甲型H1N1流感感染患者。结果共检测有流感样症状患者2156例,甲型流感病毒核酸阳性1176例,阳性率35.0%,其中甲型H1N1流感病毒核酸阳性599例,阳性率17.8%。14岁以下儿童甲型H1N1流感病毒核酸阳性283例,占甲型H1N1流感病毒核酸阳性总数的47.2%。结论实时荧光定量PCR反应快速、准确,适用于H1N1流感病毒感染的早期诊断并可作为监测手段在临床广泛开展,为控制疫情的蔓延发挥了重要作用。     

甲型H1N1流感病毒核酸检测结果不符合标准判定模式的原因分析

目的分析21例不符合甲型H1N1流感病毒核酸检测结果判定模式的原因。方法对21例出现特殊模式甲型H1N1流感病毒核酸检测结果的标本重复检测,同时对患者重新采样并利用荧光实时聚合酶联反应(RT-PCR)定量检测,将前后结果进行对照分析。结果实验操作过程中模板损失造成病毒载量降低而引起检测结果不符标准的占4.7%(1/21);采样不标准引起检测结果模式不符标准的占14.29%(3/21);患者经临床治疗后体内病毒载量降低而引起检测结果模式不符标准的占80.95%(17/21)。结论甲型H1N1流感病毒核酸检测过程中,实验操作、采样不标准以及患者经临床治疗后都有可能造成病毒载量降低而引起检测结果模式不符合结果判定标准,同时临床治疗后机体内病毒含量下降是引起检测结果不符合判定标准的主要原因。     

甲型H1N1流感病毒与非甲型H1N1流感病毒患者外周血象的对比分析

目的:对航天中心医院就诊的甲型H1N1流感病毒感染者与非甲型H1N1流感病毒感染者、正常对照者的外周血象进行对比分析,以期为临床的诊断、治疗以及病情监测提供有利的工具.方法:采用RT-PCR的方法对患者是否患甲型H1N1流感进行确认.采用流式细胞技术的方法,利用全血细胞计数仪对甲型H1N1组、非甲型H1N1组患者以及正常对照组外周血象进行对比分析.利用免疫比浊的方法对3组患者外周血中C反应蛋白(CRP)浓度进行比较分析.结果:甲型H1N1组患者中单核细胞百分数阳性百分率占77.1%,非甲型H1N1组患者单核细胞百分数阳性百分率占7.8%.正常对照组单核细胞百分数阳性百分率占6.7%.甲型H1N1组白细胞总数、淋巴细胞百分比以及嗜酸细胞百分比与非甲型H1N1组相比明显降低,但甲型H1N1组中性粒细胞百分比与正常对照组相比明显升高,而单核细胞百分比在甲型H1N1组中显著升高.甲型H1N1组血小板总数、血小板压积与非甲型H1N1组相比降低,而血小板分布宽度相比非甲型H1N1组数值升高,但与正常对照组相比,血小板总数以及3项参数未有明显差异.甲型H1N1组中CRP浓度与非甲型H1N1组相比差异无显著性,但与正常对照组相比明显升高.结论:甲型H1N1感染患者外周血象与一般流感存在相似之处,但它有其独特特点,在诊断过程中不应该以一般流感的外周血象以及CRP浓度特点来排除甲型H1N1流感病毒的感染.     

不同方法检测流感病毒的敏感性

目的 对比两种方法检测甲型H1N1流感病毒的敏感性.方法 分别利用RT-PCR与实时荧光RT-PCR方法对不同稀释度的流感咽拭子标本进行扩增,比较两种方法的敏感性.结果 RT-PCR只能对稀释100倍以下的流感标本扩增出条带,而实时荧光RT-PCR对稀释1 000倍的标本仍能出现扩增曲线.结论 实时荧光RT-PCR方...     

双重荧光定量RT-PCR快速检测甲型和甲型H1N1流感病毒

目的建立双重荧光RT-PCR快速检测方法,用于甲型和甲型H1N1流感病毒的同时检测和鉴别诊断。方法针对甲型流感病毒M基因和甲型H1N1流感病毒NA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感或甲型H1N1流感含漱液标本检测。结果该方法对甲型、甲型H1N1流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.01 TCID50和0.1 TCID50,具有较好的稳定性。可从疑似流感或甲型H1N1流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。结论本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确检测甲型和甲型H1N1流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法。     

孕妇感染甲型H1N1流感病毒合并重症肺炎的抢救及护理

总结1例孕妇感染甲型H1N1流感病毒合并重症肺炎的抢救及护理经验.及时而有效的无创正压呼吸机的使用为疾病的诊断和进一步的治疗赢得了宝贵的时间,有效的消毒隔离措施及院内转运避免了疫情的进一步扩散,连续性肾脏替代治疗(CRRT)避免了患者病情的进一步恶化.通过50余天的治疗,患者痊愈出院.     

广州地区无偿献血人群中H1N1和H3N2流感病毒中和抗体的分布及水平

目的 探讨H1N1和H3N2流感病毒中和抗体在广州地区无偿献血人群中的分布及水平,为研究广州地区流感流行病学特征提供参考.方法 于2015年10～11月,采用年龄分层随机抽样法选择广州血液中心无偿献血的498例健康献血者为研究对象.按年龄将其分为18～20岁组(n=150)、21～30岁组(n=210)、31～60岁组(n=138).采用微量病毒中和实验法测定献血者血浆中H1N1和H3N2流感病毒中和抗体滴度,并分别对不同性别及年龄段H1N1和H3N2流感病毒中和抗体阳性率及滴度进行统计学分析.结果 498例健康献血者中,H1N1流感病毒中和抗体阳性率为3.6％ (18/480);H3N2流感病毒中和抗体阳性率为4.6％ (23/498),2种流感病毒中和抗体阳性率比较,差异无统计学意义(x2=0.636,P=0.425).156例男性献血者中,H1N1和H3N2流感病毒中和抗体阳性率分别为3.8％(6/156)和4.5％(7/156);342例女性献血者中H1N1和H3N2流感病毒中和抗体阳性的率分别为3.2％(11/342)和4.4％(15/342).不同性别献血者H1N1和H3N2流感病毒中和抗体阳性率比较,差异均无统计学意义(x2 =0.129、0.003,P＞0.05).18～20岁组、21～30岁组和31～60岁组献血者H1N1流感病毒中和抗体阳性率分别为4.0％、5.2％和0.7％;H3N2流感病毒中和抗体阳性率分别为6.0％、5.2％和2.2％.不同年龄组献血者H1N1和H3N2流感病毒中和抗体阳性率比较,差异均无统计学意义(x2=4.961、2.705,P＞0.05).18～20岁组、21～30岁组和31～60岁献血者H1N1流感病毒中和抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶1.38、1∶1.48和1∶1.05,平均为1∶1.32;H3N2流感病毒中和抗体GMT分别为1∶1.62、1∶1.51和1∶1.19,平均为1∶1.44.3组献血者H1N1和H3N2流感病毒中和抗体滴度比较,差异均无统计学意义(x2 =4.887、2.702,P＞0.05).结论 广州地区无偿献血人群中H1N1和H3N2流感病毒中和抗体水平较低,不同性别和年龄人群对流感病毒普遍易感.     

新型甲型H1N1流感68例临床分析

目的:探讨上海地区甲型H1N1流感确诊病例的临床特点.方法:分析2009年5月24日至7月1日上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心收治的甲型H1N1流感68例确诊病例的流行病学及临床资料.结果:68例甲型H1N1流感确诊病例的临床特点:(1)不同性别和各年龄段均可感染和发病,但主要见于青少年,女性患者偏多.(2)首发症状多为发热.大多数为中低热,发热持续时间为1～4 d;主要症状包括发热(98.5%)、咳嗽(83.8%)、咽痛(52.9%);主要体征为咽部充血(95.6%)、扁桃体肿大(54.4%);少数患者可出现病毒性肺炎.(3)血清C反应蛋白升高和前白蛋白下降比较常见.(4)在奥司他韦治疗的前提下,患者病毒转阴时间1～7 d,中位时间4 d.结论:此次甲型H1N1流感病毒具有很强的传染性,能在人与人之间传播,并在不同国家扩散.该次流行期间的感染者大多表现出轻微的症状,患者很快痊愈.     

甲型H1N1流感患者的护理

报告了2009年5月11日收治的1例甲型H1N1流感患者的护理,在护理方面我们着重加强了消毒隔离、个人防护、心理护理及健康教育等措施,确保了该患者的成功救治,使其在隔离期间未发生护理并发症,无院内感染发生,短期内康复出院.     

Qualitative detection of avian influenza A (H5N1) viruses: a comparative evaluation of four real-time nucleic acid amplification methods

The aim of this study was to determine the performance of real-time amplification based methods - NASBA, TaqMan, RT-FRET, and RT-PCR LUXtrade mark formats - for the detection of influenza A (H5N1) virus RNA. In an analysis of 54 samples obtained from a range of animal species in Thailand during the period 2003-2006, results showed that the NASBA (H5=98.2%, N1=96.3%), TaqMan (H5=98.2%, N1=96.3%) and FRET (H5=98.2%, N1=96.3%) had significantly higher rates of positive detection than LUX (H5=94.4%, N1=50.0%; P<0.001) for influenza A, H5 and N1 isolates. There were no false-positive results from any methods used in the negative-control group of samples. The limits of analytical detection were at least 10copies/reaction in real-time NASBA and LUX assays, while FRET and TaqMan assay appeared to be less sensitive at > or =100copies/reaction. The assays were relatively specific without cross-reactivity to a number of other influenza strains or viral pathogens. In conclusion, our study demonstrated that real-time NASBA, TaqMan and FRET assays can be used to detect influenza A (H5N1) from a wide range of hosts, and be specific for H5N1 samples obtained during different outbreaks (2003-2006). All assays provided the benefit of rapid influenza H5N1 identification for early diagnosis, in the range of hours, and they are well suited to high throughput analyses.     

四重荧光定量RT PCR检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒

目的建立检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒的四重荧光定量RT-PCR方法。方法以人细胞RNA酶P(RNase P)基因为内参,用Primer Express3.0软件设计PCR特异性引物和探针。通过不同来源的呼吸道病毒进行特异性分析,构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,并对1 896例临床标本进行回顾性检测。结果该方法检测甲型流感病毒(Flu A)、H7、N9与RNase P灵敏度均达102copies/m L,特异性达100%,每对引物和探针只检测出相应的病毒,无交叉反应,检测变异系数(CV)均低于1.55%。用该法检测1 896例临床标本,结果 Flu A 235例,H7N9 127例,与其他试剂报告结果完全一致。结论建立的四重荧光定量RT-PCR法可快速检测H7N9病毒,灵敏度与特异性好,可用于H7N9病毒感染患者的早期诊断。     

危重症甲型H1N1流行性感冒病毒肺炎的临床特征——附17例报告

目的:探讨危重症甲型H1N1流行性感冒病毒(甲流)肺炎患者的主要临床特点,分析各临床检验指标与病情严重程度的关系。方法:收集入住呼吸重症监护病房(RICU)的17例危重症甲流肺炎患者的临床资料,归纳分析其临床特征。结果:17例患者以发热、咽痛、咳嗽、肌肉酸痛为主要症状。双肺多发实变影12例(71%)。入院后白细胞为(3.4～25.1)×109/L,中性粒细胞(2.72～21.84)×109/L,中性粒细胞比例58.6%～96.4%,淋巴细胞5.1%～21.6%。CRP 34.6～381.9 mg/L,乳酸脱氢酶(LDH)310～820 U/L,白蛋白<30 g/L10例(59%),ALT升高6例(35%),血清肌酐升高5例(29%),脑钠肽升高4例(24%)。氧合指数<300 mm Hg 13例(76%)。均予奥司他韦治疗,气管插管机械通气支持治疗3例(18%)。死亡2例(12%),均为男性,均为气管插管机械通气者。结论:LDH、CRP升高、炎性细胞增多提示危重症甲流肺炎患者肺部损害加重;机械通气支持治疗对于部分肺内广泛实变者效果不理想,且相关的并发症是部分患者病情加重或死亡的促发因素。     

分析甲型H1N1流感患者体内单核细胞的临床意义

目的探讨甲型H1N1患者单核细胞检测的临床意义,分析其对甲型H1N1流感起到的辅助诊断作用。方法90例健康人作对照,对90例甲型H1N1流感患者血常规单核细胞及单核细胞百分率进行定量检测,并对结果进行统计学分析。结果90例H1N1流感患者单核细胞计数及单核细胞百分率均高于健康对照组,P0.05或P0.01。结论单核细胞数及百分率的增高对甲型H1N1流感可提供辅助诊断依据,是临床医生观察病情的有效指标。     

HIV-1实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的比较实验

目的比较及评价市场上主流的3个进口品牌(A-QIAGEN、B-Applied Biosystems、C-Promega) HIV-1病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的特异性、灵敏度、稳定性及所需反应时间,确定3者中较优的试剂盒,为临床HIV-1病毒的核酸检测提供方法学参考。方法根据3个品牌试剂盒的说明书,对系列稀释的国内HIV-1 RNA标准品和确证的HIV阴性的标本进行相应的荧光定量RT-PCR平行检测分析,最后将荧光收集值(RFU)均设定为100,结合扩增曲线图、Ct值及相应的分析,比较它们的特异性、灵敏度、稳定性及所需反应时间。结果 3种试剂盒的特异性都是100%,但B-Applied Biosystems试剂盒在灵敏度(比A-QIAGEN、C-Promega试剂盒的检出Ct值提前0. 4-1. 5)、稳定性(特别是低浓度(HIV-1 RNA标本浓度为2. 31×102)时)及所需反应时间上均优于A-QIAGEN试剂盒和C-Promega试剂盒。结论不同厂家检测试剂盒的特异性、灵敏度等方面存在一定的差异,导致同样的标本检测的结果会有一定的偏差,甚至漏检。因此,进行临床检测前需要对这些检测试剂盒进行评估。     

2009年甲型H1N1流感研究近况

根据2009年甲型H1N1流感疫情及相关研究资料,回顾近代重大流感疫情的流行病学资料,介绍甲型H1N1流感病毒的结构及抗原特征、甲型H1N1流感流行病学、临床和放射学表现、并发症及目前推荐的诊断治疗策略.     

48例儿童甲型H1N1流感病例临床分析

目的探讨儿童甲型H1N1流感患者的临床特征和治疗特点。方法回顾分析广东省人民医院2009年9月19日～12月30日收治的48例住院儿童甲型H1N1流感病例的临床资料,总结其临床特征及治疗经验。结果 14例为轻症患儿,30例为重症患儿,4例为危重症患儿。48例确诊病例均为本地发病者,其中10例有明确的甲型H1N1流感患者接触史。表现为发热（100%）,咳嗽（93.8%）,气促（35.4%）,喘息（25%）,呼吸困难（4.16%）,腹泻（12.5%）;50%患儿合并肺炎,2例并发心肌炎,5例患儿合并胸腔积液,其中2例出现呼吸衰竭;75%患儿白细胞正常或减低,45.8%患儿有肌酸激酶（CK）增高。按照卫生部《甲型H1N1流感诊疗方案（2009年第三版）》给予奥司他韦抗病毒、预防感染、吸氧、营养心肌及对症支持治疗,积极治疗基础疾病,必要时给予呼吸机支持、胸腔穿刺引流,所有患儿均痊愈。结论甲型H1N1流感患儿临床表现以呼吸系统症状为主,肺炎是常见并发症,少数患儿合并胸腔积液,甚至出现呼吸衰竭;接近半数患儿伴有不同程度心肌酶损害,少数并发心肌炎;尚未发现神经系统并发症;奥司他韦治疗敏感,采取综合治疗预后良好。     

H6亚型禽流感病毒概述

2013年5月,台湾报道了首例人感染H6N1禽流感病毒病例,该病例也是人感染H6亚型禽流感的直接证据。研究发现,该病毒由在台湾家禽中流行的不同基因谱系的H6N1病毒重配而成,HA蛋白受体结合位点的一些重要氨基酸发生了突变,这些突变可能会增加病毒与人源受体的结合能力并增强该病毒对哺乳动物的致病性。本研究从病原学、流行病学、受体结合蛋白结构等方面对H6亚型禽流感病毒的特征进行了总结和分析,对于H6亚型禽流感的预警和防控工作具有一定的参考意义。     

Comparison of real-time RT-PCR, shell vial culture, and conventional cell culture for the detection of the pandemic influenza A (H1N1) in hospitalized patients

The emergence of the pandemic influenza virus A H1N1 has made fast and accurate diagnosis essential. However, few well-validated diagnostic techniques exist. The real-time RT-PCR developed by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) is the recommended technique. Our objective was to compare the CDC real-time RT-PCR assay, shell vial (SV), and conventional cell culture [with Madine-Darby canine kidney (MDCK) cells and A549] for the detection of pandemic influenza A H1N1 in hospitalized patients. We performed a prospective study comparing the efficacy of 5 diagnostic techniques (RTPCR, SV in A549, SV in MDCK, conventional cell culture in A549, and conventional cell culture in MDCK) using nasopharyngeal swabs from patients ≥18 years of age hospitalized with clinical symptoms of influenza at our institution. Detection of the virus by conventional culture was considered the gold standard. An "extended gold standard" was also used to recalculate validity values. The sensitivities, specificities, positive predictive values, and negative predictive values (NPVs) for the detection of influenza A H1N1, determined using conventional culture as the gold standard, were, respectively, as follows: RT-PCR: 95.6, 82.3, 78.3, 96.5%; SVA549: 91.2, 99.01, 98.4, 94.4%; SV-MDCK: 82.3, 100, 100, 89.4%; tube-A549: 94.12, 100, 100, 96.2%; tube-MDCK: 86.7, 100, 100, 91.9%. Sensitivities and NPVs using an extended gold standard were as follows: RT-PCR: 96.5%, 96.6%; SV-A549: 73.3%, 78.5%; SV-MDCK: 65.1%, 73.7%; tube-A549: 74.4%, 79.2%; tube-MDCK: 68.6%, 75.7%. The average time to detect pandemic influenza A H1N1 by RT-PCR, SV culture, and conventional culture was, respectively, 4 h, 48 h, and 7 days. Real-time RT-PCR displayed high sensitivity and specificity for the detection of influenza A H1N1 in adult patients when compared with conventional techniques. In addition, the A549 cell line was not inferior to the MDCK line.