重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化方法比较研究

目的研究重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化条件。方法采用羊抗人Fab抗体亲和层析柱、14F7单克隆抗体亲和层析柱、离子交换-分子筛层析柱,分别纯化由酵母工程菌(Gs115／Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并对3种纯化方法所得Fab抗体的纯度、收率、与HBsAg的结合活性进行比较。结果3种纯化方法中,14W单克隆抗体柱纯化的Fab抗体的纯度达98％左右,Fab抗体柱纯化的Fab抗体的纯度为95％,但这两种亲和柱的目的蛋白收率都不高,分别为35％、55％。而离子交换柱纯化的Fab抗体的纯度为93．8％,经分子筛柱进一步纯化后,可达98％以上,Fab抗体蛋白收率可达80％以上。经ELISA分析,3种方法纯化的Fab抗体均具有较高的HBsAg抗原结合力和特异性。结论通过对3种纯化方法的比较得出,离子交换一分子筛层析法是重组人抗HBsAg Fab抗体的最佳纯化方法,这为抗HBsAg Fab抗体的产业化生产和临床研究打下良好基础。     

人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究

目的：探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法，以期大量获取人源抗HBsAg Fab。方法：在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律，筛选最佳的培养模式及诱导表达条件，后于发酵罐中行补料高密度发酵试验，以确定最佳补料模式。结果：由摇瓶发酵获得的数据表明，当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点，在250℃下以O．2％arabinose诱导12h条件下Fab的产率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大OD600达到55．2，相当于湿菌含量110g/L水平。同时，经证实Fab的抗原结合活性良好。结论：确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

抗结肠癌抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达

目的：大肠杆菌中表达抗结肠癌抗体Ｆａｂ片段,比较表达产物和原杂交瘤单克隆抗体的抗原结合特性,方法：以ＤＮＡ重组法的构建重组表达质粒,在大肠杆菌中进行表达,对表达产物包涵体进行复性,用ＥＬＩＳＡ法和ＳＡＢＣ法测定复性产物的抗原结合特性。结果：构建了抗结肠癌相关抗原抗体Ｆａｂ片段的重组表达质粒ｐＧＬ４,在大肠杆菌ＪＭ８３中获得表达,表达Ｆａｂ片段占全菌蛋白的２１％,主要以包涵体形式存在,对包涵体进行分     

基因工程人抗体Fab片段的纯化及鉴定

 目的通过亲和层析的方法纯化基因工程人抗体Fab(Fragment,antigen binding)片段.方法对可以表达人抗体Fab的菌种进行诱导,冻融裂菌离心收集上清,进行亲和层析并对纯化前后的样品进行电泳分析及Western blot检测.结果SDS-PAGE电泳显示纯化品在还原、非还原条件下均为单一条带.Western blot分析层析前抗体Fab片段还原的分子量在2.4×104左右,非还原的分子量约为4.8×104,而经过亲和层析后,在凝胶电泳上纯化品在还原、非还原条件下在相应位置上均显示单一蛋白带.结论我们可以经过亲和层析,纯化基因工程抗体Fab片段.     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

人抗乙型肝炎表面抗原Fab片段的表达及活性鉴定

人抗乙型肝炎表面抗原Ｆａｂ片段的表达及活性鉴定２００００３上海第二军医大学长征医院范列英，韩焕兴，胡东平，孔宪涛关键词ＨＢｓＡｇ，Ｆａｂ片段，噬菌体抗体中国图书资料分类号Ｒ５１２．６２噬菌体抗体技术不仅能大量制备人源性单克隆抗体，而且为制备其他的具有...     

非竞争性ELISA法测定人源抗HBaAg Fab功能性亲和常数

目的 测定完全人源化基因工程抗体HBsAg Fab的亲和常数。方法 采用非竞争性ELISA同相法，经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后，得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAg Fab及完整抗体抗HBsAg IgG的抗原抗体结合反应曲线，计算出抗HBsAg Fab及抗HBsAg IgG的亲和常数。结果 人源基因工程抗体抗HBsAg Fab的功能性亲和常数在10^7～10^8M^-1水平，比完整抗HBsAg IgG仅仅小约1个数量级(10^8～10^9M^-1)。结论 该基因工程抗体与抗原结合能力较强，为今后开发府用Fab进行牛物导向治疗提供了理论基础。     

非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的　测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法　采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体结合反应曲线 ,计算出抗HBsAgFab及抗HBsAgIgG的亲和常数。结果　人源基因工程抗体抗HBsAgFab的功能性亲和常数在 10 7～10 8M 1水平 ,比完整抗HBsAgIgG仅仅小约 1个数量级 (10 8～ 10 9M 1)。结论　该基因工程抗体与抗原结合能力较强 ,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础。     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。     

人抗HBsAg噬菌体抗体Fab段基因的序列分析及表达

对已建的噬菌体抗体库分离出来的人抗－ＨＢｓ克隆进行了序列分析和表达研究，发现４个克隆中３个克隆的重链和轻链完全相同，ＤＮＡ序列分析表明ＶＨ分别属于ＶＨ１亚群和Ⅱ亚群，其轻链ＶＬ分别属于ＶλⅡ亚群和ＶλⅠ亚群。构建了可溶性Ｆａｂ段表达载体，显示出在细菌中表达的Ｆａｂ段抗体与ＨＢｓＡｇ特异性结合，这说明所筛选出来的噬菌体抗体具有ＨＢdisplay status     

A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析

目的：在酵母系统中实现A型肉毒毒素(BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达。方法：将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K，用SacⅠ将重组质粒线性化，电转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞，筛选G418抗性阳性整合子，进行Mut^ 表型株甲醇快速利用诱导。结果：经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化，毒素Hc在pH6．5培养基BMMY中实现稳定的分泌表达，最终筛选到蛋白表达量占上清蛋白10％的分泌高表达株。免疫印迹和酶联免疫检测结果显示，重组BoNTa Hc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性，可以诱导小鼠产生特异性抗体。结论：酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子。     

毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析

目的：通过毕赤酵母（Pichia pastoris）表达制备重组人凝血酶原2（prothrombin-2）,并利用锯鳞蝰（Echis carinatus）凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据GenBank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体pPICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3．1（＋）,瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺（pNA）,且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。     

大鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达与培养条件优化

目的:利用毕赤酵母表达系统,表达大鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,同时探讨最优表达条件,为规模化发酵生产羧肽酶B奠定基础。方法:以RTPCR法从SD大鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,转入毕赤酵母Gs115细胞,在甲醇的诱导下表达目的蛋白。结果与结论:首次实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达;通过表达条件的优化,使用BMGY(pH6.0)培养基,添加0.5%(体积比体积)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF,于28℃,每隔12h补加0.5%(体积比体积)的甲醇,重组酵母Gs115proCPB表达的重组蛋白可达500mg/L,表达的目的蛋白占总蛋白的94%,活化后的重组CPB相对分子质量为35.1×103,与理论值(35.2×103)极相近。活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB的比活力可达110U/mg(CPB参照品为180U/mg)。     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白在糖基工程化毕赤酵母中的表达

目的在糖基工程化毕赤酵母中表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白（tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc）,考察糖基工程化过程对其活性的影响。方法将编码TNFR-Fc的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA中,构建重组表达质粒pPIC6-TF。用表达质粒转染N-糖基化工程改造的毕赤酵母菌株GSB,在含有杀稻瘟菌素的YPD平板上进行筛选。然后再使用HRP标记的羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行斑点印迹（dot-blot）筛选。选择表达量较高的工程菌株TNFR-Fc/GSB57进行高密度培养,通过Protein A亲和层析从发酵上清中纯化融合蛋白,利用鼠L929细胞对融合蛋白的抗TNFα活性进行分析。结果通过筛选获得了表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达菌株,纯化后的TNFR-Fc融合蛋白拮抗TNFα的EC50高于野生型毕赤酵母表达产物,而低于哺乳动物细胞的表达产物。结论糖基化改造改善了人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的抗TNFα活性,但必须进行进一步的改造才可能获得与哺乳动物细胞表达产物相似的活性。     

人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

重组人血清白蛋白在酵母中的表达及分析鉴定

目的：实现重组人白蛋白（rHSA)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达,方法：将本室构建的rHSA表达载体转化毕赤酵母,用G418筛选抗性克隆,SDS－PAGE与Western印迹检测并鉴定表达产物;采用生化法、电泳扫描及Brodford法、竞争ELISA3种方法测定摇瓶培养条件下rHSA的表达量。结果：Western印迹分析发现转移至膜上的酵母表达产物能与抗人血清白蛋白单克隆抗体结合,相对分子质量与人血白蛋白一致,证明在酵母中成功地表达了rHSA。在甲醇诱导下摇瓶培养,rHSA表达量随诱导表达时间的延长而增加,第8天产量约为3．5g/L。结论：人血清白蛋白表达载体与毕赤酵母基因组整合,获得酵母表达株,摇瓶培养,该株表达量为3．5g/L。     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。     

抑瘤素M在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

目的：构建抑瘤素M（oncostatinM,OSM)的酵母表达体系,方法：将人OSM cDNA连入pPIC9K酵母表达载体,转染毕赤酵母（Pichia pastoris),用MD和MM营养缺陷型培养基筛选具有正确表型的重组转化子,用RNA印迹法和蛋白质印迹法鉴定母转化菌株中OSMmRNA转录和OSM相对分子质量。MTT法鉴定OSM蛋白对人黑素瘤细胞生长的抑制活性。结果：构建的毕赤酵母体系可实现人OSM分泌表达,表达量占外分泌蛋白的70％以上,表达蛋白相对分子质量约30000,对黑素瘤细胞生长可产生明显抑制作用。结论：OSM的酵母分泌表达体系表达量可观,表达蛋白集中于培养液上清,便于纯化,是日后进行OSM大规模制备的可行途径。