小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

小鼠体细胞核移植技术的初步研究

目的 :建立细胞核移植技术 ,为“治疗性克隆”的实验研究和临床应用作准备。方法 :以C5 7鼠的卵丘细胞为核供体细胞 ,去核卵母细胞为核受体进行胚胎的重构。用改良的WAKAYAMA方法 ,分别进行卵丘细胞的分离、分裂中期卵母细胞的去核、供体细胞核的注射、重构胚的电融合以及卵母细胞的活化等研究。结果 :去核卵母细胞的成活率 3 8.4%。成活的小鼠胚胎发育进入二细胞期。盲吸法比半卵法和功能性吸核的效果好。电融合法能够使移植核融入卵母细胞内。结论 :小鼠体细胞核移植技术基本获得成功     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

卵丘细胞线粒体移植对年老小鼠早期胚胎发育的影响

目的探讨线粒体对早期胚胎发育的影响。方法采用昆明小鼠为动物模型,以其卵丘颗粒细胞、卵母细胞、受精卵为试验材料,提取年老小鼠卵丘细胞线粒体,将其注入年老小鼠卵母细胞和体内冲出的受精卵中。结果与结论通过卵丘细胞线粒体移植,给卵子补充了一定量的线粒体,可以部分弥补卵母细胞因变异引起的功能不足。为第2次减数分裂、受精卵和胚胎发育提供足够的能量,明显改善了胚胎的质量。     

利用废弃胚胎行人原核移植方法的初步建立

【目的】探索利用废弃胚胎进行人原核移植的方案。【方法】收集废弃多原核受精卵117个。用显微操作-电融合的方法构建原核移植重构胚胎。分别比较钙离子浓度0．05mmol／L（n=39）和0．1mmol／L（n=58）的两种电融合液以及电压分别为1800V／cm（n=58）和2000V／cm（n=20）的两种电场条件对重构合子融合率和发育的影响。【结果】操作成功率70．1％，融合成功率59．8％，得到43个卵裂胚胎，其中23个（53．5％）6细胞以上胚胎。共14个重构胚发育至8细胞或以上，得到3个囊胚。将电压由2000V／cm下降到1800V／cm，重构胚胎融合率、卵裂率和囊胚率的差异没有统计学意义（P〉0．05），但6．细胞率明显上升（22．2％vs60．9％，P〈0．05）。和钙离子浓度为0．05mmol／L的融合液比较，0．1mmol／L的融合液融合率明显上升（39．3％强69．0％，P〈0．05），卵裂率、6．细胞率和囊胚率皆无统计学差异（P〉0．05）。【结论】通过显微操作．电融合的方法，用废弃胚胎重构人核．质异质的胚胎模型，是可行的、经济的。     

小鼠体细胞核移植的早期研究

目的 建立成熟的小鼠体细胞核移植技术。方法 通过显微操作，以ICR鼠成纤维细胞核和C57鼠的去核卵母细胞进行胚胎的重构。重构胚经化学激活或3种不同脉冲电压融合后再经体外或输卵管体内培养；3d后回收胚胎并进行胚胎的发育鉴定。结果 去核卵母细胞的成活率为71．91％、化学激活率为75．09％；刺激电压为60V(80μs、刺激5次)的融合率比其他几种方式高；经脉冲电压70V(80μs、刺激2次)处理后的胚胎发育潜力比其他几种方式处理后的胚胎发育潜力要好。结论 小鼠体细胞核移植技术基本获得成功。     

不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响

目的:研究不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响,建立一种简单有效的核移植方法.方法:以小鼠卵丘细胞作为体细胞核移植的供核细胞,采用4种去核方法(盲吸法、蔗糖辅助去核法、化学去核法、荧光染色去核法)研究卵母细胞去核率的差异,并比较胞质内注射法和反向核移植法应用于小鼠体细胞核移植的效果.结果:荧光染色法的去核率(88%)显著高于其他试验组(P<0.05),但囊胚率和囊胚细胞数与蔗糖辅助去核法无明显差异(P>0.05);胞质内注射法构建重构胚的效率与反向核移植法相似(P>0.05),但胞质内注射法的囊胚率和囊胚细胞数较反向核移植高(P<0.05).结论:荧光染色去核法和胞质内注射法构建体细胞核移植胚胎效率较高,可维持胚胎早期发育.     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后,将直径为10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活。体外培养72h,对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s;Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核;去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

成熟卵泡比例与ＨＣＧ注射时机的选择及对卵子发育潜能的影响

【目的】 探讨采用成熟卵泡比例来决定ＨＣＧ注射时机的可行性,研究在不同成熟卵泡比例的情况下注射ＨＣＧ对卵子发育及妊娠结局的影响,摸索最适合的成熟卵泡比例。【方法】 本回顾性研究共纳入１９８例需行单精子胞浆注射（ＩＣＳＩ）助孕治疗的女性不孕患者。按照ＨＣＧ日成熟卵泡（≥１８ｍｍ）的不同比例将患者分成３组：①低比例组：成熟卵泡比例 ≤ ２０％;②中比例组：２０％ ＜ 成熟卵泡比例 ≤ ４０％;③高比例组：成熟卵泡比例 ＞ ４０％,注射ＨＣＧ后３６ｈ取卵,将获得的卵丘复合物剥除卵丘颗粒细胞用于检测ＧＲＥＭ１和ＨＡＳ２基因的ｍＲＮＡ表达水平。分别统计和比较３组患者卵子成熟、受精、胚胎发育及临床妊娠情况。【结果】卵子成熟率在低比例组显著低于中比例组和高比例组（Ｐ ＜ ０．０５）。正常受精率在３组间无显著差异（Ｐ ＞ ０．０５）。异常受精率在低比例组显著低于中比例组和高比例组（Ｐ＜ ０．０５）。卵裂率、可利用胚胎数在低比例和中比例组之间无显著差异,但均高于高比例组（Ｐ ＜ ０．０５）。优质胚胎率、种植率、妊娠率在低比例组均显著高于中比例组和高比例组（Ｐ＜ ０．０５）。卵丘颗粒细胞ＧＲＥＭ１和ＨＡＳ２基因ｍＲＮＡ表达水平在低比例组显著高于中比例组和高比例组（Ｐ ＜ ０．０５）。【结论】 采用成熟卵泡比例决定ＨＣＧ的注射时机可以更全面地反映卵泡的整体发育状态,并为把握ＨＣＧ注射时机提供更为准确的依据。随着成熟卵泡比增加卵子的发育潜能逐渐降低,因此注射ＨＣＧ时应将成熟卵泡的比例控制在一定范围较合适。     

不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响

目的：：探讨不同冷冻方法对小鼠卵母细胞存活率及其发育潜能的影响。方法：采用玻璃化冷冻技术,选取开放式载体与封闭式载体分别冻存带卵丘细胞(COC)或剥除卵丘细胞(OD)的小鼠卵丘复合体,复苏后分别作体外受精,胚胎培养。结果：开放式载体冻存组存活卵数76.79%略高于封闭式载体冻存组72.98%,无统计学意义(P >0.05);两组内 COC 组的卵子存活率显著高于 DO 组,但有统计学差异(P <0.05),COC 组的受精率、囊胚率略高于 DO 组,无统计学差异(P >0.05)。结论：(1)封闭式载体有效避免了潜在的污染问题,但不同载体对卵子存活率无显著影响。(2)卵丘细胞在玻璃化冷冻卵母细胞中可以起到保护作用,并对胚胎后期的发育有一定的改善。     

用全染色体涂抹探针进行卵母细胞第一极体荧光原位杂交

【目的】建立用全染色体涂抹探针（WCP）对卵子第一极体进行荧光原位杂交（FISH）检测染色体的方法。【方法】收集单精子卵胞浆内注射（ICSI）中不成熟卵母细胞经体外培养成熟和常规试管婴儿（IVF）中未能成功受精的成熟卵母细胞，活检第一极体，固定后行13、14号染色体的全染色体涂抹探针荧光原位杂交。活检后，一部分卵母细胞固定行FISH以分析卵子自身的13、14号染色体，其余行ICSI受精，观察受精和卵裂情况。【结果】共获得成熟母细胞93个，成功活检85个，成功固定78个，共29个第一极体处于分裂中期，均有FISH结果。卵母细胞体外培养成熟后立即取极体进行固定，90．5％（19／21）的极体处于分裂中期，而取卵后30-48h和72h后活检的第一极体处于分裂中期的比例分别为27．3％（6／22）和11．4％（4／35），3组相比有统计学差异（P〈0．01）。11个卵母细胞同时获得了极体和相对应卵细胞的FISH结果，其中10个极体和相对应的卵细胞分别有1条13，14号染色体，剩余1个卵母细胞的极体有2条14号染色体和1条13号染色体，相对应的卵细胞仅有1条13号染色体，二者互补。活检后行ICSI受精的卵母细胞受精率为78．6％（11／14），优质胚胎率45．5％（5／11）。【结论】全染色体涂抹探针对卵子第一极体进行遗传分析可以有效、准确地推测相对应卵母细胞的染色体构成，从而应用于女性染色体易位患者的植入前遗传诊断。     

用全染色体涂抹探针进行卵母细胞第一极体荧光原位杂交

 【目的】建立用全染色体涂抹探针（WCP）对卵子第一极体进行荧光原位杂交（FISH）检测染色体的方法。【方法】收集单精子卵胞浆内注射（ICSI）中不成熟卵母细胞经体外培养成熟和常规试管婴儿（IVF）中未能成功受精的成熟卵母细胞，活检第一极体，固定后行13、14号染色体的全染色体涂抹探针荧光原位杂交。活检后，一部分卵母细胞固定行FISH以分析卵子自身的13、14号染色体，其余行ICSI受精，观察受精和卵裂情况。【结果】共获得成熟母细胞93个，成功活检85个，成功固定78个，共29个第一极体处于分裂中期，均有FISH结果。卵母细胞体外培养成熟后立即取极体进行固定，90．5％（19／21）的极体处于分裂中期，而取卵后30-48h和72h后活检的第一极体处于分裂中期的比例分别为27．3％（6／22）和11．4％（4／35），3组相比有统计学差异（P〈0．01）。11个卵母细胞同时获得了极体和相对应卵细胞的FISH结果，其中10个极体和相对应的卵细胞分别有1条13，14号染色体，剩余1个卵母细胞的极体有2条14号染色体和1条13号染色体，相对应的卵细胞仅有1条13号染色体，二者互补。活检后行ICSI受精的卵母细胞受精率为78．6％（11／14），优质胚胎率45．5％（5／11）。【结论】全染色体涂抹探针对卵子第一极体进行遗传分析可以有效、准确地推测相对应卵母细胞的染色体构成，从而应用于女性染色体易位患者的植入前遗传诊断。     

卵子第一极体形态与胚胎形态和临床妊娠关系分析

【目的】了解卵子第一极体形态与胚胎形态和临床妊娠的关系。【方法】对因男性因素不育的 91例患者进行单精子卵胞浆内注射 (ICSI)治疗 91个周期 ,进行ICSI操作时对卵子第一极体形态评定 ,胚胎移植当天对胚胎形态进行评定 ,胚胎移植后确定临床妊娠 ,分析卵子极体形态与胚胎形态和临床妊娠之间的关系。【结果】随着极体形态不规则化 ,取卵后第 3天胚胎发育≥ 6个细胞的胚胎比例和碎片 (2 0 %的胚胎比例呈下降趋势 ;使用射出精进行单精子卵胞浆内注射的 74例患者妊娠组中移植的 1级和 2级极体胚胎总比例显著高于非妊娠组 (P <0 0 5 ) ,且在 <35岁患者组中随移植胚胎中 1、2级极体胚胎数目的增多 ,临床妊娠率和多胎妊娠率增高。在使用附睾精和睾丸精患者中 ,妊娠组移植的 1级和 2级极体胚胎比例高于非妊娠组 ,但不具统计学差异。【结论】对卵子极体评定有助于选择好质量的胚胎进行移植。     

卵母细胞体外成熟评价标准的改良研究

目的探讨改良式人未成熟卵母细胞评分标准的可行性和颗粒细胞指标的合理性及其对卵子发育潜能的影响。方法体外培养卵丘-卵母细胞复合体,按改良式人未成熟卵母细胞评分标准,将未成熟卵母细胞分为优质卵和非优质卵,对成熟卵母细胞进行受精,并对胚胎进行评价;用琼脂糖凝胶电泳检测两类卵的颗粒细胞凋亡。结果优质卵的成熟率、卵裂率和优质胚胎率都优于非优质卵,优质卵成熟数和优质胚胎数与非优质卵比较差异有统计学意义（P<0.01）;非优质卵其卵丘细胞DNA凝胶电泳后形成明显DNA 梯带,凋亡程度高于优质卵的卵丘细胞。 结论改良式人未成熟卵母细胞评分标准在临床上具有可行性。     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响，寻找最佳电融合参数。方法 将直径10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核一卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者问的融合，并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动，变动范围分别是电场强度1000-2000kV／cm和脉冲时程40～160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核一卵母细胞复合体的融合率．而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内，供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异，并且融合后重组胚的激活，以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外，脉冲重复次数以1～2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

昆明小鼠卵子的体外受精及其新培养系统的建立

本研究首次将CZB培养液应用于昆明小鼠早期胚胎的培养，建立了一个可行的胚胎体外培养的新方法，采用昆明种成熟雄鼠附睾尾部精子与常规超排法得到的卵子在TYH培养液中进行体外受精后，将卵子分别移入WM和CZB培养液中进行发育培养。WM中的胚胎发生阻滞而未能继续发育；CZB培养液中的胚胎有79%发育至4细胞期，81%的胚胎发育至桑椹胚阶段，突破了胚胎培养中存在的“2细胞阻滞”现象。而于胚胎培养的不同阶段向培养液中添加葡萄糖也未表现出明显的作用。表明在昆明小鼠胚胎培养的早期阶段，葡萄糖并非一种重要的营养物质。     

人卵和胚胎线粒体ATP合酶表达的研究

目的探讨ATP合酶表达与卵子发育潜能间的关系。方法收集行常规体外受精(IVF)和单精子卵胞质内注射(ICSI)不受精的成熟卵母细胞25个，不适合移植及冷冻保存的胚胎30个，应用免疫组织化学方法检测单个卵子和胚胎ATP合酶的蛋白表达。结果ATP合酶均匀地表达于人卵和胚胎的卵裂球中。未受精人卵中表达呈弱阳性；胚胎中的表达呈强阳性；有碎片的胚胎中，碎片部位ATP合酶的表达明显较卵裂球降低。结论ATP合酶蛋白表达减少可能通过干扰卵子的能量代谢以及正常的受精过程而参与受精失败，并与卵子的发育潜能密切相关。     

短时受精后早剥卵对胚胎质量及妊娠结局的影响

摘 要： 【目的】 探讨短时受精后早期剥除颗粒细胞对体外受精胚胎质量及妊娠结局的影响。【方法】 回顾性分析２０１２年在本中心助孕的有早剥卵的１０３个ＩＶＦ周期与７４个ＩＣＳＩ周期,以ＩＣＳＩ组为对照,比较两组的２ＰＮ受精率、多ＰＮ受精率、可利用胚胎形成率、卵裂期优质胚胎形成率、种植率和临床妊娠率,再以ＩＶＦ周期中的卵子是否进行早剥分为两组,比较早剥对ＩＶＦ周期中２ＰＮ受精率、多ＰＮ受精率、可利用胚胎形成率、卵裂期优质胚胎形成率、种植率和临床妊娠率的影响。【结果】在ＩＶＦ周期中共有１１８１枚卵子纳入研究,其中早剥卵子５１３枚,非早剥卵子６６８枚,在ＩＣＳＩ周期中共有６１９枚成熟卵子纳入研究。结果显示,ＩＶＦ组的２ＰＮ受精率、卵裂期优质胚胎形成率低于ＩＣＳＩ组,多ＰＮ受精率高于ＩＣＳＩ组,差异有统计学意义（Ｐ＜ ０．０５）;其余比较均无统计学差异。而ＩＶＦ的全部卵子中,早剥卵子组的２ＰＮ受精率、多ＰＮ受精率、可利用胚胎形成率、优质胚胎形成率、种植率、临床妊娠率与非早剥组相比,均无统计学差异（Ｐ＞ ０．０５）。 【结论】 与传统ＩＣＳＩ相比,短时受精后早期剥除卵丘颗粒细胞并未降低可利用胚胎形成率;与常规ＩＶＦ相比,早剥也未提高多ＰＮ受精率;早剥卵是安全的,并能够使受精情况不明的患者受益。     

猪体细胞核移植胚的体外发育及其影响因素

以卵丘细胞为核供细胞组成重构胚 ,卵裂率达以5 6 .7% ,发育至桑椹胚达 11.7%、孵化囊胚率为 6 .7% ,显著高于成纤维细胞重构胚 (P<0 .0 5 )。作者还研究了卵母细胞的采集方法、激活程序和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响 ;以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至 G0或 G1期 ,抽吸法 /解剖法采集卵母细胞 ,体外培养 33或 4 4 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中 ,重构胚以钙离子载体 A2 3817或电脉冲结合6 - DMAP激活处理 ,体外培养 6 d,结果表明 ,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素 (CB)、激活程序并不影响重构胚的发育 (以…