人脑源性神经生长因子基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以人脑ＤＮＡ为模板,扩增了人脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）成熟序列的ＤＮＡ 片断并将此ＤＮＡ 片段克隆到载体ＰＢＶ２２０中。对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定、限制性酶切分析和序列测定后,确定其为含ＢＤＮＦＤＮＡ 的重组质粒。将该质粒转染到大肠杆菌（ＤＨ５ α）中,通过温度诱导其表达,其表达量占菌体总蛋白的１５％ 。用兔抗人ＢＤＮＦ进行蛋白质印迹分析（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）后,在表达产物位置（１４Ｋｄ）出现特异性条带,证实该产物为ＢＤＮＦ     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RUNX3为模板,通过Kpn1和Xho1酶切位点将RUNX3定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果双酶切获得1300bp片段,证明RUNX3片段被成功导入pGEX-4T-2,并在测序后与GenBank进行同源性比对,比对进一步证实原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3构建成功,并用IPTG诱导,SDS-PAGE方法证实了GST/RUNX3融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。     

重组体p5 TBF在大肠杆菌中表达产物的活性鉴定

目的为了进一步深入了解BDNF的生物作用,开展基因工程以及应用基础的研究,需要大量的BDNF.因此构建原核表达重组体就显得非常重要.方法从本室已构建的pGEMBF克隆中获取人BDNF全长编码片段与原核表达载体pGEX-5T连接,构成p5TBF重组体后,经转化大肠杆菌和IPTG诱导.结果该重组体经蛋白质含量测定,免疫狭缝杂交和ELISA测定,表明该菌体裂解液具有人BDNF抗原活性.结论p5TBF重组体在大肠杆菌中表达成功.     

小鼠LIGHT胞外段基因原核表达质粒的构建及表达

目的 构建含有LIGHT胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法 从由小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增LIGHT胞外段,克隆至原核表达载体pEF-24a( )中,构建重组表达质粒pET24-LIGHYECD.重组质粒经酶切鉴定及序列测定后,转化E. coli BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果 RT-PCR扩增出了525 bp LIGHT胞外段的cDNA,经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出相对分子质量为20 000的LIGHT胞外段蛋白.结论 成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

人CD20胞外区片段原核表达质粒的构建

ＣＤ20是Ｂ细胞表面特有的抗原结构,为一种跨膜的非糖基化蛋白。它通过参与Ｃａ2 离子通道而对Ｂ细胞的分化和成熟进行调控,同时还通过参与细胞内的酪氨酸激酶信号转导途径而对细胞周期进行调控,促进细胞通过Ｇ1期进入Ｓ期。研究发现,ＣＤ20的过度表达与细胞癌变有关,尤其...     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

人BDNF的克隆、表达及其活性检测

为了研究脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Parkinson病中的作用,采用RT-PCR技术,从人胚脑组织扩增及克隆了BDNF全长及其成熟蛋白编码基因,经测序证实后,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pGEX6p-1,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-BDNF和重组原核表达载体pGEX6p-BDNFs。pcDNA3.1-BDNF经脂质体介导转染至体外培养的E16胚鼠中脑星形胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与E12-E14胚鼠中脑神经干细胞体外共培养,酪氨酸羟化酶免疫细胞化学反应显示,转染细胞株所表达的BDNF蛋白具有生物学活性,可延长前体细胞的存活并促进其向多巴肢神经元分化。将pGEX6p-BDNFs转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约为40 kD的GST-BDNF融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的10％,并经免疫印迹证实具有特异的免疫反应性。     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

hBDNF基因在成纤维细胞中的异位表达

将hBDNF全长编码序列插入人Ⅰ型胶原基因（Colia1）增强子－启动子调节序列之下,构建了含Colia1-BDNF微基因的重组pSCEPBFCAT,并转染人胚肌腱成纤维细胞。成功地利用了Colia1基因调控元件介导DBNF基因在成纤维细胞中异位表达,SDS－PAGE显示表达产物分子量为27kDa,免疫斑点杂交、Elisa和Western杂交证实该表达产物具有BDNF抗原活性。     

人乳头瘤病毒16型 E5基因克隆、原核表达及产物鉴定

目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.     

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.结果酶切及DNA序列测定鉴定正确.SDS-PAGE和Western Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75 200的蛋白,与DT-hs120融合基因子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体.结论 成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达.     

核心链霉亲和素基因的克隆及表达

文章采用PCR方法 ,以链霉亲和素菌 (Streptmycesavidinii)基因组DNA为模板 ,克隆出 384bp的DNA片段并以BamHI及XhoI位点装入PSK载体 ,经测序确证为核心链霉亲和素基因 (core strepavidin )。将该基因重组到质粒pET 2 4a ( + ) ,构建重组表达质粒pET 2 4a CS。转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导后得到高效表达。SDS PAGE图谱显示表达产物相对分子质量为15 0 0 0 ,与其基因编码蛋白的理论值相符。HRP标记的生物素作为抗体进行Westernblot,结果在 15 0 0 0处可见特异性条带 ,因此表明核心链霉亲和素能与生物素特异性结合     

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:从小鼠肝脏组织克隆canstatin cDNA并在大肠杆菌(E.coli)中表达, 为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法: 用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin(m canstatin)的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin cDNA 定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中, 在大肠杆菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达。结果:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin的cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中表达。结论: 首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA, 其原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。     

3-羟酰基辅酶A脱氢酶在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的：克隆并在大肠杆菌中表达3-羟酰基辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HCDH）并制备其抗血清。方法：通过PCR方法扩增HCDH基因片段，经DNA测序证实后克隆到原核表达载体pMAL-P2X，重组质粒转化大肠杆菌DE3，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达结果，经麦芽糖树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫獭兔，琼扩和ELISA检测抗血清的效价，Western blot检测其特异性。结果：PCR扩增得到786bp的目的片段，序列测定证实与GeneBank上登录的序列一致；成功构建了HCDH基因片段的原核表达载体；在详细探索表达条件的基础上，成功诱导HCDH的表达，并制备了相应的抗血清。结论：检测HCDH蛋白在表达水平上的变化及为HCDH基因表达调控的进一步研究奠定了基础。     

中华绒螯蟹重组金属硫蛋白的原核表达与分离纯化

金属硫蛋白(MT)由于其独特的结构和性质,而成为潜在的医用蛋白资源。本研究将重组中华绒螯蟹金属硫蛋白基因cDNA克隆入原核表达载体pET-GST,转化大肠杆菌BL21。重组蛋白以可溶和包涵体两种形式表达。根据金属硫蛋白的特性,优化了表达条件。Western blot证实了表达产物的正确性,用锌柱亲合层析得到高纯度的重组金属硫蛋白。为以后金属硫蛋白的生物学功能研究奠定了良好的基础。