大鼠睾丸Leydig细胞的培养和鉴定

目的:研究体外培养大鼠睾丸Leyd ig细胞的有效方法。方法:原代培养大鼠睾丸Leyd ig细胞,用4 U/m l人绒毛膜促性腺激素(hCG)作用细胞,对照组未用hCG,放射免疫法测定培养液中睾酮浓度,3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫组化染色观察睾丸Leyd ig细胞形态和生物学特性。结果:培养细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高。接种72 h后大鼠睾丸Leyd ig细胞纯度达95%。接种后24 h内,hCG刺激组较对照组睾酮分泌量明显提高(P<0.05)。结论:体外培养的睾丸Leyd ig细胞可分泌高浓度的睾酮;睾丸Leyd ig细胞的纯化和培养方法的建立,可为中老年男性雄激素部分缺乏综合征睾酮替代治疗的基础和临床研究提供一条可行的思路。     

小鼠胚胎睾丸Leydig细胞培养、纯化及其功能研究

目的:探讨小鼠胚胎睾丸Leyd ig细胞体外培养、鉴定、纯化的方法,并进行形态学观察、分泌睾酮能力等生物学特性检测。方法:选择胎龄16 d的胎鼠睾丸,0.03%胶原酶Ⅰ消化,3β-羟基类固醇脱氢酶(HSD)染色鉴定及纯度测定,锥虫蓝染色检测细胞活率。放免法测定Leyd ig细胞不同培养时间及密度下分泌睾酮的水平。结果:Leyd ig细胞培养前和培养72 h后纯度分别为(45.10±1.66)%和(81.17±2.32)%;培养液中可检测到睾酮,睾酮水平与Leyd ig细胞数、培养时间相关,单个Leyd ig细胞睾酮分泌能力逐日下降。结论:该法分离的胚胎Leyd ig细胞纯度较高,生长性好,保持增殖和分泌睾酮的生物学特性,可应用于相关的研究。     

ATP50荧光表达载体构建及其在TM3小鼠睾丸Leydig细胞定位研究

目的:构建ATP50的荧光表达载体,研究其在原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达和在TM3小鼠睾丸Leyd ig细胞中的定位。方法:原代培养小鼠睾丸Leyd ig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究ATP50在小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达。利用BamH I和EcoR I酶切位点把ATP50克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-ATP50在TM3小鼠睾丸Leydig细胞的定位。结果:ATP50表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,绿色荧光的YFP-ATP50和红色荧光的线粒体标记物M ito-tracker有完全的共定位。结论:ATP50在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建了ATP50真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-ATP50定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞睾酮合成功能障碍的研究提供重要的信息,有利于进一步深入研究。     

长期给予睾酮致大鼠生精小管伴有生精细胞排列疏松

目的:确定睾酮致大鼠睾丸内睾酮抑制因而精子发生障碍是否伴有生精细胞排列疏松。方法:成年雄性SD大鼠肌注十一酸睾酮[19 mg/(kg.15 d)]130 d后取睾丸组织块,作甲基丙烯酸树脂包埋切片,观察睾丸的组织学变化。结果:除精子形成、精子释放障碍等改变以外,11.5%的生精小管轮廓内生精细胞的排列明显较疏松,成串、成束或成团的生精细胞(主要是精母细胞和精子细胞)之间出现朝向小管腔走行的放射状裂隙。结论:生精细胞排列疏松是大鼠睾丸内睾酮抑制所致重要组织学改变之一。     

环境污染物三丁基氯化锡和氯化三苯锡对大鼠睾丸Leydig细胞的影响

目的:探讨环境污染物三丁基氯化锡(TBT)和氯化三苯锡(TPT)对大鼠睾丸Leyd ig细胞的影响。方法:①用0~80 nmol/L浓度的TBT和TPT处理大鼠睾丸Leyd ig(LC-540)细胞24~96 h,用四唑蓝(MTT)法确定细胞的存活率;②用DNA片段法确定是否存在细胞凋亡;③观察细胞内Ca2+螯合剂氨基苯乙烷四乙酸(BAPTA)和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89、蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203X、酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂Gen iste in是否可以阻断TBT所致的细胞凋亡;④检测TBT处理的原代大鼠睾丸Leyd ig细胞分泌睾酮的变化。结果:①TBT和TPT影响Leyd ig细胞存活率的强度基本相同,在20~80 nmol/L浓度时细胞存活率呈剂量和时间依赖性降低;②DNA片段法研究证实TBT和TPT可引起细胞凋亡;③BAPTA可阻断20 nmol/L的TBT所致的细胞凋亡,而PKA、PKC和TPK抑制剂对细胞存活率没有影响;④TBT可减少Leyd ig细胞分泌睾酮,并使其对人绒毛膜促性腺激素(hCG)刺激的反应性降低。结论:环境污染物TBT和TPT能直接导致睾丸Leyd ig细胞凋亡,并抑制睾酮分泌,这种致凋亡作用可能与细胞内Ca2+浓度增加有关。     

有机磷农药-敌敌畏诱导大鼠尿道下裂动物模型睾丸组织的病理学初步观察

目的:探讨环境内分泌干扰物-有机磷农药敌敌畏导致尿道下裂发生的可能机制。方法:30只SD大鼠随机分为两组:实验组(20只)和对照组(10只)。于孕12~17 d分别以敌敌畏10 mg/(kg.d)和生理盐水灌胃。实验组产雄仔鼠88只,其中22只发生尿道下裂,对照组产雄仔鼠33只,无尿道下裂发生。实验组(尿道下裂鼠)和对照组各5只仔鼠喂养至性成熟,取其睾丸组织作常规石蜡切片分别用HE染色和用抗大鼠Calretin in抗体作SP免疫组化染色检测。结果:尿道下裂大鼠睾丸组织中间质细胞(Leyd ig)数量明显减少,生精小管数及形态无明显改变;尿道下裂大鼠睾丸组织中Calretin in阳性的Leyd ig细胞数明显少于对照组。结论:孕SD大鼠染毒敌敌畏农药后能导致雄性仔鼠睾丸组织中的Leyd ig细胞数量减少,推测环境内分泌干扰物质敌敌畏诱导大鼠尿道下裂发生的可能机制是敌敌畏的毒性作用致使胎鼠睾丸中的Leyd ig细胞受损,导致胎鼠睾丸产生的睾酮水平降低,在尿道形成过程中发生障碍而产生尿道下裂。     

精子发生阻滞不育患者睾丸雄激素受体和热休克蛋白90α的表达

目的 :探讨精子发生阻滞与雄激素受体 (AR)和热休克蛋白 90α(HSP90α)表达的关系。　方法 :应用免疫组化二步法 ,检查 5 7例精子发生阻滞引起的不育患者睾丸活检标本AR和HSP90α的表达 ,并以 15例正常健康人睾丸组织作为对照。　结果 :在正常健康人睾丸组织中 ,AR在精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞、支持细胞、间质细胞和肌样细胞的胞核均有表达 ,但各类细胞表达AR的强度有差异。在精子发生阻滞的睾丸组织中 ,AR高表达主要在阻滞细胞水平的胞质 ,即在核周形成一环行特异性免疫反应阳性产物带。HSP90α在正常睾丸组织精原细胞、精母细胞、支持细胞、间质细胞和肌样细胞的胞质表达 ;在精子发生阻滞的睾丸组织中 ,HSP90α为高表达 ,正常睾丸组织和精子发生阻滞的睾丸组织 ,其表达强度存在显著性差异 (P <0 .0 5 )。　结论 :AR表达部位异常可能无法介导雄激素进入核内 ,而不能实现对基因转录或翻译的调节 ,致使生精细胞难以进入细胞周期而呈现阻滞。HSP90α的高表达可能加剧AR稳定性降低 ,进而增强了AR的遍在化反应。     

Attractin蛋白在不同病理分型无精子症患者睾丸组织中的表达

目的探讨Attractin蛋白在不同生精功能状态的人睾丸组织中的表达情况。方法对31例无精子症患者进行睾丸组织病理检查诊断,根据病理形态的不同分为:唯支持细胞综合征型(n=4),生精功能低下型(n=12),生精阻滞型(n=5),生精功能基本正常型(n=10)。选择上述各型结构完整的睾丸组织,分别应用免疫组化法(SP)观察Attractin蛋白在不同生精功能状态的睾丸组织中的表达。结果各组睾丸组织内均存在Attractin蛋白的表达,其分布特点为:睾丸生精小管和间质细胞、管周肌样细胞、支持细胞上均有Attractin蛋白的表达,主要表达于胞膜和胞质,胞膜表达强于胞质。Leydig细胞、Sertoli细胞、精原细胞、精母细胞及精子细胞均为阳性表达,呈棕黄色着染。Attractin的表达与生精功能有关,正常组表达明显高于其它组,唯支组表达明显低于其他组。结论 Attractin蛋白与男性生殖密切相关,但其具体作用环节尚有待进一步研究。     

Mahoganoid蛋白及其mRNA在大鼠睾丸和附睾中的表达

目的:探讨M ahoganoid(Md)蛋白及其mRNA在成熟大鼠睾丸和附睾组织中的表达。方法:健康成年SD大鼠20只,取睾丸和附睾组织4%多聚甲醛固定,石蜡切片,用免疫组化SP法和原位杂交方法分别检测Md蛋白及其mRNA在睾丸和附睾组织中的表达。结果:免疫组化SP法显示:睾丸组织间质细胞、睾丸生精小管管周肌样细胞和各级生精细胞(精原细胞、初级精母细胞和精子细胞)、支持细胞呈阳性反应,Md蛋白主要表达于胞膜及胞质。在附睾组织,棕色免疫阳性反应物质可见于输出管的高柱状细胞、低柱状细胞的胞膜及胞质,以及附睾管的高柱状细胞、主细胞、基细胞的胞膜及胞质。其中,在附睾尾部的上皮细胞中仅见微弱的棕色免疫阳性反应物质。原位杂交方法显示:睾丸组织间质细胞、睾丸生精小管管周肌样细胞和各级生精细胞(精原细胞、初级精母细胞和精子细胞)、支持细胞上也均有Md mRNA阳性棕色颗粒杂交信号,主要表达于胞膜及胞质。在附睾组织,Md mRNA阳性棕色颗粒杂交信号也均可见于高柱状细胞、主细胞、基细胞的胞膜及胞质。结论:Md蛋白及其mRNA在成熟大鼠睾丸和附睾组织中均有表达,其生理功能尚有待阐明。     

邻苯二甲酸二乙基己酯对新生小鼠睾丸及Leydig细胞影响的实验研究

目的:探讨邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对新生小鼠睾丸及Leyd ig细胞形态结构及功能的影响。方法:DEHP分别以低、中、高3组剂量[100、200、500 mg/(kg.d)]灌胃作用于怀孕12 d到产后3 d(GD12~PND3)的KM母鼠,观察DEHP对新生雄性仔鼠体重、睾丸重量、Leyd ig细胞形态结构和3β-羟基类固醇脱氢酶(3-βHSD)活性、酶反应面积的影响。结果:DEHP作用于母鼠后,其雄性子代幼鼠体重和睾丸重量减轻,睾丸Leyd ig细胞形态、超微结构发生改变;高剂量组Leyd ig细胞数量明显增多;低、中剂量组睾酮合成关键酶3β-HSD酶活性下降,酶反应面积减小,但高剂量组在仔鼠出生后15 d时酶活性降低[(吸光度值(0.154±0.011)vs空白对照组(0.222±0.013),P<0.01],而酶反应面积增大[(6 303.0±745.6)μm2vs空白对照组(5 091.4±214.4)μm2,P<0.01)]。结论:DEHP能影响新生雄性小鼠体重、睾丸重量、Leyd ig细胞的形态结构和3β-HSD活性,具有抗雄激素效应。     

Attractin蛋白和mRNA在不同日龄大鼠睾丸中的表达

目的:已知成熟大鼠睾丸组织中有Attractin蛋白的广泛表达,本文旨在进一步探讨Attractin蛋白和AttractinmRNA在各年龄段大鼠睾丸组织中的分布。方法:取出生第1d(新生鼠)、第5d(青春前期)、第20d(青春中期)、第50d(青春后期)及第70d(成年期)大鼠睾丸和附睾组织固定,采用酶免疫组织化学和原位杂交方法检测Attractin和AttractinmRNA在大鼠睾丸组织中的表达。结果:免疫组化显示各年龄段大鼠睾丸生精小管和间质细胞、管周肌样细胞上均有Attractin蛋白的表达,分布于胞膜和胞质,精子和附睾上未见表达。随着日龄的增加,间质细胞的表达逐渐增强。原位杂交显示各年龄段大鼠睾丸生精小管和间质细胞、管周肌样细胞、支持细胞上也均有AttractinmRNA阳性棕色颗粒杂交信号,主要表达于胞核及胞质。且随着日龄的增加,睾丸生精细胞表达略强于间质细胞。精子和附睾上未见表达。结论:AttractinmRNA和Attractin蛋白在各日龄大鼠睾丸组织中均有广泛的分布,且分布一致。提示各日龄大鼠睾丸组织都具有合成Attractin蛋白的能力。其生理功能和机制尚有待进一步探讨。     

血管内皮生长因子和其受体Flt-1在青春期大鼠睾丸、附睾及附睾内精子上的表达研究

目的:通过对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flt-1在大鼠睾丸、附睾及附睾内精子上表达的研究,探讨其在雄性生殖系统中的作用。方法:免疫组化SP法和免疫荧光法检测20只青春期SD大鼠睾丸、附睾及精子上VEGF和Flt-1蛋白的表达情况。结果:VEGF和Flt-1在大鼠睾丸和附睾组织及精子上均有特征性表达。睾丸内VEGF蛋白表达于生精细胞、精子细胞发育中的顶体、Sertoli和Leydig细胞胞质内;Flt-1只见于精子细胞发育中的顶体及Leydig细胞胞质中。附睾中VEGF表达于各段上皮主细胞胞质内,而Flt-1表达于头、尾段上皮主细胞胞质内,体部免疫染色阴性;两者在附睾上皮亮细胞、晕细胞和基细胞中均为阴性表达。免疫荧光染色显示,VEGF和Flt-1共同定位于附睾内精子头部的顶体,尾部的颈、中和主段。结论:VEGF和Flt-1蛋白在大鼠睾丸、附睾及精子中的特异性表达提示,他们可由不同生精上皮细胞、间质细胞和附睾主细胞产生,可能以自分泌或旁分泌的形式单独或共同作用于睾丸和附睾的生殖细胞或Leydig细胞,直接或间接地影响精子的发生、发育和成熟过程,并与精子的活动和受精能力有关。     

重组蛋白Cox7a2原核表达及鉴定

目的:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7a2基因,构建pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达和鉴定重组蛋白。方法:应用RT-PCR方法从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7 a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点把Cox7a2克隆到pGEX4T-1载体,酶切和测序鉴定后,诱导重组蛋白的表达,进行纯化后,利用蛋白免疫印迹进行鉴定。结果:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞克隆到Cox7a2完整的编码序列,构建了pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白,并经免疫印迹检测鉴定。结论:成功克隆Cox7a2,表达纯化了其融合蛋白,为基因的功能研究奠定了前期基础。     

Attractin蛋白在大鼠睾丸和附睾中的免疫组织化学定位

目的 :探讨Attractin蛋白在成熟大鼠睾丸和附睾组织中的分布。　方法 :健康成年雄性SD大鼠 2 0只 ,灌流取睾丸和附睾组织固定 ,石蜡包埋和冰冻切片。用免疫组化法和间接免疫荧光方法检测Attractin蛋白在成熟大鼠睾丸和附睾组织中的表达。　结果 :睾丸组织间质细胞、睾丸精曲小管管周肌样细胞和各级生精细胞 (精原细胞、初级精母细胞和精子细胞 )、支持细胞呈阳性反应 ,主要表达于胞膜及胞质。睾丸间质细胞表达略强于生精细胞。附睾头、体、尾均未见表达。　结论 :Attractin蛋白在成熟大鼠睾丸组织间质细胞和生精细胞中有较强的表达 ,其生理功能尚有待进一步探讨。     

衰老雄性大鼠睾丸组织脂质过氧化与睾酮水平和bcl-2基因表达的研究

目的:探讨衰老雄性大鼠睾丸组织脂质过氧化对血清睾酮(T)水平和睾丸间质(Leyd ig)细胞bcl-2基因表达的影响。方法:由D-半乳糖建立亚急性衰老模型,SD大鼠20只随机均分为对照(C)组和D-半乳糖(D)组,用分光光度计检测睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量、放免法检测血清中T水平以及免疫组化检测Leyd ig细胞bcl-2基因表达情况。结果:①SOD活性:D组(116±18.09)U/mg.prot显著低于C组(156±31.02)U/mg.prot(P<0.01);②MDA含量:D组(1.77±0.41)nmol/mg.prot明显高于C组(1.19±0.15)nmol/mg.prot(P<0.05);③血清T:D组(2.39±0.90)nmol/L显著低于C组(8.95±2.53)nmol/L(P<0.01);④bcl-2基因表达:D组(35.1±3.6)%明显低于C组(49.6±7.4)%(P<0.01)。结论:衰老大鼠睾丸组织脂质过氧化的变化影响T水平和Leyd ig细胞bcl-2基因表达。     

睾丸大细胞钙化型支持细胞瘤临床病理观察

目的:探讨睾丸大细胞钙化型支持细胞瘤的临床及病理组织学特征。方法:运用组织学、免疫组化及组织化学技术对1例睾丸大细胞钙化型支持细胞瘤进行光镜观察及免疫标记,并结合相关文献对其临床表现、组织形态、免疫组化特点及治疗和预后等进行分析。结果:患者为青年男性,病理组织学表现为肿瘤细胞排列成巢状、梁状,细胞呈多角形,胞质嗜酸,核大空泡状,伴间质广泛钙化。免疫组化染色显示肿瘤细胞inh ib in(+)、S-100(+)和vim entin(+),PLAP(-)、SMA(-)、CK(-)、AFP(-)。组织化学染色阿辛蓝(+)、过碘酸雪夫氏反应(PAS)阴性。结论:大细胞钙化型支持细胞瘤是一种罕见的睾丸性索间质肿瘤;免疫组化有助于睾丸大细胞钙化型支持细胞瘤的诊断,鉴别诊断包括精原细胞瘤的管状型、睾丸间质细胞瘤(Leyd ig细胞瘤)、普通型及硬化型支持细胞瘤、雄激素不敏感综合征以及隐睾中的支持细胞结节等,手术切除预后良好。     

超生理剂量十一酸睾酮引起生精细胞凋亡的动态研究

目的：以生精细胞凋亡作为指标探讨超生理剂量十一酸睾酮（ＴＵ）抑制精子发生的机制。方法：正常生育史男性２０例肌内注射ＴＵ,应用瑞－吉染色和ＴＵＮＥＬ法对精液中脱落细胞进行凋亡率的动态检测。结果：用药后精子密度和生精细胞数较用药前显著下降（Ｐ〈０．０１）。精母细胞和精子细胞凋亡则显著上升（Ｐ〈０．０１）。结论：ＴＵ具有显著的抑制精子发生的效应,其作用机制除通过抑制促性腺激素而导致睾丸内睾酮（Ｔ）浓度很     

不同剂量的十一酸睾酮对大鼠生精功能影响

目的 :进一步了解睾丸内睾酮和生精功能的关系。　方法 :大鼠给予不同剂量的十一酸睾酮 (TU)后测定大鼠血清、睾丸间质液和睾网液内睾酮水平 ,以及附睾精子的数量、活力 ,以观察二者之间关系。结果 :大鼠给予不同剂量的十一酸睾酮后 ,睾丸内睾酮水平发生不同的变化 ,随之睾丸内生精功能也发生变化。低剂量十一酸睾酮(8mg/kg)不影响睾丸内睾酮水平 ,也不影响睾丸内的生精过程。附睾精子的数量、活动力与对照组无显著性差异。但给予超生理剂量 (30mg/kg) ,则抑制睾丸内睾酮的产生 ,睾丸内睾酮水平显著下降 ,使精子的发生明显受到抑制。而给予超大剂量的外源性睾酮 (6 2 5mg/kg) ,尽管抑制了睾丸内睾酮的产生 ,但由于补充了大量外源性睾酮 ,使睾丸内睾酮维持在正常水平。精子的发生能维持在正常水平。附睾精子的数量与活动力与对照组无显著性差异。　结论 :进一步论证了睾丸内高浓度的睾酮对维持生精过程起到决定性的作用     

超生理剂量十一酸睾酮引起生精细胞凋亡的动态研究

目的：以生精细胞凋亡作为指标探讨超生理剂量十一酸睾酮（ＴＵ）抑制精子发生的机制。方法：正常生育史男性２０例肌内注射ＴＵ,应用瑞－吉染色和ＴＵＮＥＬ法对精液中脱落细胞进行凋亡率的动态检测。结果：用药后精子密度和生精细胞数较用药前显著下降（Ｐ＜０．０１）,精母细胞和精子细胞凋亡率则显著上升（Ｐ＜０．０１）。结论：ＴＵ具有显著的抑制精子发生的效应。其作用机制除通过抑制促性腺激素而导致睾丸内睾酮（Ｔ）浓度降低,继之使精子发生停滞外,还可能有促进生精细胞凋亡的作用。     

五味子对模拟航渡及高强度运动大鼠垂体-睾丸轴及糖代谢的影响

目的:研究五味子对实验性模拟航渡及高强度运动雄性大鼠睾丸轴功能、超微结构及糖代谢的影响。方法:选取34只SD雄性大鼠,分为安静对照组(A组)、应激对照组(B组)、五味子处理组(C组),B组和C组参照Bedford的训练模式进行训练,分别以生理盐水和五味子灌胃1周,每日2次。实验结束后,取血以放免法测定血清睾酮(T)、皮质酮(CORT)、血清黄体生成素(LH)、葡萄糖(G lu)水平,同时随机取垂体、睾丸组织在电子显微镜下观察其超微结构。结果:①A组血G lu为(5.22±2.13)mmol/L,T为(0.61±0.68)ng/m l,CORT为(4.67±1.19)ng/m l;B组血G lu为(9.41±2.56)mmol/L,较A组水平升高(P<0.01),T为(0.10±0.15)ng/m l,与A组相比水平降低(P<0.01),CORT为(7.25±6.20)ng/m l,与A组无明显差异(P>0.05);C组血CORT为(3.55±3.52)ng/m l,G lu为(5.09±1.64)mmol/L,较B组水平均显著降低(P<0.05,P<0.01),T为(0.11±0.12)ng/m l,较B组无明显变化(P>0.05);LH在3组之间均无显著变化(P>0.05)。②电子显微镜观察发现,B组垂体细胞胞质中分泌颗粒较A组显著减少,C组与B组相比胞质中分泌颗粒的数目明显增多,B组睾丸Leyd ig细胞线粒体肿胀,电子密度增高,嵴减少或消失,C组睾丸Leyd ig细胞中线粒体结构趋向于正常,可见大小不等深染的分泌颗粒。结论:模拟航渡及高强度运动训练抑制睾丸功能并影响细胞内超微结构,灌服五味子对垂体-睾丸轴具有保护作用,同时可降低应激大鼠的血糖水平。