金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因的克隆及其原核表达

目的在大肠杆菌中克隆表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因,即腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因,所得片段与pGEX-4t-1(+)载体连接,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白作鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783bp,始于ATG,止于TAG,预测的等电点和相对分子质量分别为7.75和29×103,目的基因与Genbank腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55×103见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因。     

葡萄糖-6-磷酸异构酶与类风湿性关节炎的研究进展

葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)是糖酵解和糖异生过程中的一种重要酶类,在类风湿性关节炎(RA)患者的血清和关节液中其浓度明显增高,有可能成为RA的一个新的临床实验室诊断指标。同时,研究GPI在类风湿性关节炎中的作用机制,为今后开辟新的针对RA的治疗方法及其对药物开发具有重要意义。     

葡萄糖6-磷酸异构酶与类风湿关节炎关系的研究

目的研究血清中葡萄糖6-磷酸异构酶(GPI)抗原与类风湿关节炎(RA)的关系。方法检测57例RA患者和32例健康对照者的血清GPI抗原浓度、类风湿因子(RF)。结果 RA患者GPI浓度中位数为1.11mg/L,GPI阳性率显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPI在RA患者血清中升高,可作为辅助诊断RA的一个新指标。     

金黄色葡萄球菌SrtA Δ N59基因的克隆及原核表达载体构建

<正>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是一种人畜共患的病原菌,主要引起败血症、肺炎、脑膜炎、心内膜炎及肠炎等细菌感染性疾病~([1,2])。SA对环境的适应性较强,对临床应用的抗生素易产生耐药性~([3])。在临床中可供选择的药物种类不多,通过基因水平分析其耐药性,寻找抗菌靶点将成为治疗SA引起特异性感染的一条重要途径。转肽酶A(Sortase A,SrtA)是金黄色葡萄球菌管家基因,在金黄色葡萄球菌致病过程中发挥着关键性作     

霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD的克隆表达

目的克隆表达霍乱弧菌甘露醇特异性磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统操纵子中的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD。方法以测序株N16961染色体为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增mtlD基因,扩增产物经NdeⅠ和XhoⅠ酶切后克隆入表达载体pET-30a。0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声裂解上清经Ni柱亲和层析纯化,比色法测定酶活性。结果 mtlD基因成功克隆入表达载体pET-30a,在宿主菌BL21中诱导表达,利用Ni亲和层析柱获得较高纯度的羧基端带His标签的MtlD蛋白,并具有酶活性。结论表达纯化了有活性的霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶,为进一步的功能研究打下了基础。     

葡萄糖-6-磷酸异构酶在类风湿关节炎中的意义

类风湿关节炎(RA)是一种免疫功能紊乱所引起的自身免疫性疾病.患者体内存在多种自身抗原和自身抗体,不同患者的自身抗原可能不同,自身抗原或非自身抗原产生的免疫反应是RA产生或持续存在的原因.触发免疫的自身抗原很大程度上为软骨或关节特异性抗原.     

葡萄糖6-磷酸异构酶与类风湿关节炎患者临床表现的关系

目的探讨葡萄糖6磷酸异构酶(G6PI)抗原在类风湿关节炎(RA)的发生发展中的作用。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测140例RA患者、75例其他风湿性疾病患者和50名健康对照者血清中G6PI抗原的浓度,同时检测RA患者C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、血沉(ESR),关节疼痛和肿胀数以及X线分级等。结果 RA组血清G6PI抗原浓度为(3.13±2.62)μg/mL,明显高于其他风湿性疾病组(0.148±0.045)μg/mL和健康对照组(0.107±0.065)μg/mL。RA组G6PI抗原阳性率明显高于其他风湿性疾病组和健康对照组(P<0.01)。RA活动组G6PI抗原浓度及阳性率高于RA非活动组(P<0.05)。G6PI抗原浓度和RA患者疼痛和肿胀关节数及CRP呈正相关。结论 G6PI抗原在RA的发病及关节损伤中有一定的作用,有可能成为诊断RA、判断其疾病活动性及疗效监测的一个辅助指标。     

血清葡萄糖-6-磷酸异构酶与自身免疫性疾病相关性研究

目的探讨血清葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）水平与各种自身免疫性疾病（AID）的关系。方法比较正常对照和各种AID确诊病例的血清GPI浓度,分析GPI在各种AID中的检测价值。结果类风湿性关节炎（RA）组的GPI浓度和阳性率都显著高于其他AID组和正常对照组（P〈0．001）,系统性红斑狼疮（SLE）组、干燥综合征（SS）组、多发性肌炎（PM）组、进行性系统性硬皮病（SSC）组和强直性脊柱炎（AS）组GPI的阳性率均在25％以下,显著低于RA组的阳性率（71．0％）。结论在各种AID中,RA组血清中GPI升高最明显。血清GPI检测可作为RA的诊断指标。如果GPI和类风湿因子（RF）联合检测,将对RA的诊断具有较高价值。     

血清葡萄糖-6-磷酸异构酶与自身免疫性疾病相关性研究

目的探讨血清葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)水平与各种自身免疫性疾病(AID)的关系。方法比较正常对照和各种AID确诊病例的血清GPI浓度,分析GPI在各种AID中的检测价值。结果类风湿性关节炎(RA)组的GPI浓度和阳性率都显著高于其他AID组和正常对照组(P<0.001),系统性红斑狼疮(SLE)组、干燥综合征(SS)组、多发性肌炎(PM)组、进行性系统性硬皮病(SSC)组和强直性脊柱炎(AS)组GPI的阳性率均在25%以下,显著低于RA组的阳性率(71.0%)。结论在各种AID中,RA组血清中GPI升高最明显。血清GPI检测可作为RA的诊断指标。如果GPI和类风湿因子(RF)联合检测,将对RA的诊断具有较高价值。     

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

6-磷酸葡萄糖异构酶抗原在类风湿性关节炎中的表达及初步研究

目的检测昏磷酸葡萄糖异构酶（GPI）抗原在类风湿关节炎（RA）中的表达情况,探讨其在RA中的诊断价值及临床意义。方法用ELISA法测定116例RA患者、50例疑似RA患者、114例非RA患者及60例健康人血清中的GPI抗原。比较活动性RA患者与非活动性RA患者的GPI抗原水平。分析GPI抗原水平与类风湿因子（RF）的相关性。结果GPI抗原对RA诊断的敏感性为84．5％,特异性为96．6％;GPI抗原与类风湿因子存在相关性,两者联合检测敏感性增加至90．5％;活动性RA患者与非活动性RA患者GPI抗原水平有显著性差异（P〈0．01）;不同的X线分期GPI抗原水平有显著性差异（P〈0．01）。结论GPI抗原对RA的诊断具有良好的敏感性和特异性,并与RA的活动性及病程进展相关,有助于RA诊断及病情的判断。     

金黄色葡萄球菌高保守性fib基因的鉴定及其表达

金葡菌为全球性重要致病菌之一，它产生大量的细胞外蛋白，是重要的致病因子，包括凝固醇和纤维蛋白原结合蛋白（Fibrinogen－BindingFib）在内。后者可与纤维蛋白原结合，与金葡菌粘附于静脉内导管或内皮细胞有关，也可增加中性粒细胞的杀菌活性。Fib分子量为19kDa，它存在于金葡菌体内，但由于金葡菌分泌的水解酶的作用，不能100％检测出来，故Fib基因常用于金葡菌的鉴定。作者等曾纯化制备出Fib，它与凝固酶的C-末端区具有同源性。作者进一步从DNA水平，mRNA和蛋白质水平对Fib基因和Fib进行了研究。临床分离的葡萄球菌中，只有金…     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记克隆起源

早在1964年就已认识到,莆萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)的多形性可用于分析人类恶性疾病的克隆起源。在造血分析中,随着体外克隆技术的发展,结合选择性细胞标志物G-6-PD的酶型分析,能提供克隆形成细胞的正常或癌性起源的直接证据,确定发生“突变”的细胞水平。近年来,在“克隆性血液病”的研究中已有许多报道。本文就体外克隆技术联合G-6-PD标记克隆起源的有关方面,作一简要综合。细胞体外培养无标志作用祖细胞体外培养技术,可以对正常人和骨髓功能异常的病人作造血调节分析,它能提供可以识别的骨髓成分的数目、增殖潜能、分化     

葡萄糖-6-磷酸异构酶在诊断类风湿关节炎中的意义

目的 探讨类风湿关节炎(BA)患者外周血单个核细胞(PBMC)中葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)mRNA及血清中GPI抗原表达与RA发病机制及活动性的关系,分析比较GPI与抗突变型瓜氨酸波形蛋白(MCV)抗体、抗环瓜氨酸多肽(CCP)抗体、类风湿因子(RE)在RA诊断中的价值.方法 用实时荧光定量逆转录(FQ-RT)-PCR检测60例RA患者(活动期28例、缓解期32例)、30例其他风湿性疾病患者、30名健康体检者PBMC中GPI mRNA的表达水平和含量[以△Ct=Ct1(待测基因)-Ct2(内参基因)来比较基因表达水平的高低];同时用ELISA检测各组血清中GPI和抗MCV抗体,抗CCP抗体和RF水平.结果 RA患者GPI mRNA表达水平[△Ct=4.21(3.04～7.23)]明显高于其他风湿性疾病组[△Ct=8.42(5.16～9.98),P<0.01]和健康对照组[△Ct=8.66(4.90～10.01),P<0.01],活动期组GPI mRNA表达水平[△Ct=3.78(1.28～6.09)]与缓解期组[△Ct=5.88(3.23～8.94)]的差异有统计学意义(H=11.760,P<0.01);RA组血清GPI水平[3.02(2.02～8.39)mg/L]明显高于其他风湿性疾病组[0.20(0.11～0.32)mg/L]和健康对照组[0.18(0.08～0.30)mg/L],且RA活动期组血清GPI水平[4.84(2.81～10.38)mg/L]与缓解期组[2.12(1.26～4.34)mg/L]差异也有统计学意义(H=9.830,P<0.01).同时检测GPI、抗MCV抗体和抗CCP抗体对RA的敏感度分别为68%(41/60)、57%(34/60)、58%(35/60);特异度分别为95%(57/60)、92%(55/60)、93%(56/60).结论 GPI mRNA可能参与了RA的发病过程,并与疾病的活动性相关,血清中GPI对RA诊断有相对较高的敏感度和特异度,可作为临床诊断RA的辅助指标.     

6-磷酸葡萄糖异构酶检测在类风湿关节炎中的意义

类风湿关节炎（Rhematoid Arthritis，RA），由抗原驱动及T细胞介导自身免疫性疾病。主要病理变化是关节滑膜有慢性炎症和血管翳的形成，致使软骨和骨的破坏，最终导致关节变形或强直。随着检验医学的进展，RA的实验室诊断对疾病的早期诊断、疾病的发展、疗效观察和预后判断有一定的价值。6-磷酸葡萄糖异构酶（Glucose-6-phosphate isomerase，GPI）是糖酵解和糖异生代谢中酶，     

儿童葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原检测参考范围的建立

目的建立儿童葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）抗原浓度检测的临界值。方法采用固相酶联免疫吸附试验（ELISA）检测775名正常对照者[分别按年龄（≤3岁、4-6岁、7-9岁和〉9岁）和性别（男、女）分组]及53例类风湿关节炎（RA）患儿G6PI抗原浓度。采用受试者工作特征（ROC）曲线确定G6PI的临界值。结果≤3岁、4-6岁、7-9岁和（9岁正常对照者G6PI抗原浓度分别为0.126±0.069、0.127±0.079、0.129±0.072和（0.126±0.072）mg/L,各组间差异均无统计学意义（P〉0.05）。以性别分组,男、女G6PI抗原浓度分别为0.124±0.089和（0.123±0.065）mg/L,2组间差异无统计学意义（P〉0.05）。RA组G6PI抗原浓度[（0.517±0.298）mg/L]显著高于正常对照组[（0.127±0.073）mg/L,P=0.00]。当临界值在0.27 mg/L时,G6PI抗原用于RA诊断的特异性为95.1%,敏感性为79.2%;当临界值在0.32 mg/L时,其特异性为96.2%,敏感性为65.4%。结论深圳地区儿童G6PI抗原检测当临界值在0.27和0.32 mg/L时,具有较好的诊断符合率,且无年龄、性别差异。     

葡萄糖6-磷酸异构酶在类风湿性关节炎诊断中的意义

目的探讨血清中葡萄糖6-磷酸异构酶（GPI）及类风湿因子（RF）等指标与类风湿性关节炎（RA）的关系。方法对39例类风湿性关节炎患者、52例其他自身免疫性疾病和32例健康对照者检测血清中GPI、RF、CRP及ESR水平,分析四者之间的关系及其与RA的关系。结果 RA组GPI、RF、CRP、ESR水平均明显高于非RA组和正常对照组,差异具有显著性（P〈0.05）,GPI与RF（r=0.576P〈0.05）、ESR（r=0.411P〈0.05）、CRP（r=0.422P〈0.05）具有明显的正相关。GPI与CRP、ESR的曲线下面积比较均有显著性差异（P〈0.05）,GPI与RF联合检测的敏感性、特异性及准确性分别为89.7%[80.2%-99.3%]、72.6%[58.6%-86.6%]和78.1%[65.1%-91.0%]。GPI与RF联合检测的敏感性及准确性明显高于二者单独检测（P〈0.05）。结论 GPI与RF联合检测提高了RA诊断的敏感性及准确性。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础