重组人血管抑素(rhAGN)包涵体变性与复性初探

在优化的培养条件下，进行rhAGN 5L罐发酵-菌体干重由原摇瓶发酵的3．02g／L增加到8.06g／L，表达量依然稳定在35％；对所产生的包涵体进行溶解变性研究，确定较佳变性缓冲液组成为8mol／L，尿素50mmol／L Tris-HCl，20mmol／LDTT，pH值8．0；凝胶过滤色谱复性效果相对较好，蛋白浓度4．28μg/ml(IC50)时对HEMC细胞的抑制活性达50．1％。     

包涵体蛋白质的复性研究进展

外源基因在大肠杆菌中高效表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体——包涵体。包涵体中富含表达的重组蛋白质,它们经分离、洗涤、变性溶解以及复性等过程才能得到具有生物活性的蛋白质。近年来,随着对包涵体体外复性机制的深入研究,从包涵体中复性重组蛋白质已经有了很多的策略和方法。文章就有关工作的进展进行了综述。     

从EDTA处理的重组E.coil中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%.采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400 u/(mg蛋白).     

从EDTA处理的重组E.coli中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65％。采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90％,酶比活力为5400u／（mg蛋白）。     

重组人超氧化物歧化酶包涵体的复性和纯化

当工程菌接种量为3％～5％，菌体密度（D600）达0．4～0．6，并于42℃诱导3～5h时，目的蛋白表达量约为总蛋白的30％。采用透析法使包涵体复性，经金属螯合亲和色谱和凝胶色谱两步纯化后，获得了纯度约为90％、比活力达7300u／（mg蛋白）的重组人超氧化物歧化酶。     

人粒细胞集落刺激因子包涵体的提取及其复性研究

研究人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）包涵体的复性方法。方法：采用我室发明的包涵体提纯新方法。结果：复性回收率可达９０％以上,生物活性达天然比活的８０％以上。结论：对ｒｈＧ－ＣＳ Ｆ包涵体提纯和复性的研究,建立了ｒｈＧ－ＣＳＦ的复性新方法。     

重组人超氧化物歧化酶的复性

目的将E .coli以包含体形式表达的重组人超氧化物歧化酶 (rhSOD)恢复天然活性。方法分离包含体 ,用 6mol/L尿素处理 ,透析 ,添加Cu2 + 、Zn2 + ,温浴。结果Cu2 + 、Zn2 + 的加入对于恢复SOD的活性和稳定性是必需的 ,适当提高温度将大大缩短复性时间 ,获得的rhSOD比活可达到 6 0 0 0u/mg以上。结论恢复重组蛋白的天然构型是rhSOD有效结合Cu2 + 、Zn2 + 和完全复性的必要条件     

人血管生长素重组大肠杆菌发酵条件优化

考察了Mg^ 、Ca^ 、NH^ 4、PO^3-4-等无机离子、初始pH、装液量以及诱导前添加葡萄糖对重组大肠杆菌表达rhANG和菌体生长的影响。经过优化，rhANG表达量提高约39％，菌体干重达1．59g／L，为工程菌发酵的扩试提供了参考。     

在大肠杆菌表达体系中以包涵体形式存在的真核生物蛋白质的分离、复性和二硫键的形成

在大肠杆菌中表达的含有二硫键真核生物的重组蛋白，往往以包涵体的形式存在。存在于包涵体的重组蛋白，因分子内及分子间二硫键的错配，而常常导致重组蛋白无生物活性。着重介绍了一些从包涵体中分离有正确配对的二硫键重组蛋白新的技术条件，总结了含有二硫键真核生物重组蛋白的不同分离和复性步聚及方法，并对重组蛋白在体外折叠的机理进行了探讨．     

在大肠杆菌表达体系中以包涵体形式存在的真核生物蛋白质的分离…

在大肠杆菌中表达的含义二硫键真核生物的重组蛋白，往往以包涵体的形式存在，存在于包涵体的重组蛋白，因分子内及分子间二硫键的错配，而常常导致重组蛋白无生物活性，着重介绍了一些从包涵体中分离在正确配对的二硫键重组蛋白新的技术条件，总结了含有二硫键真核生物重组蛋白的不同分离和复性步骤及方法，并对重组蛋白在体外折叠的机理进行了探讨。     

重组人血管生长素基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达重组人血管生长素 (rhANG)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵 ,研究不同宿主菌对表达rhANG的影响 ,同时对培养基、诱导时期、诱导时间和初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用E .coliCDH为宿主菌 ,在SOB培养基中培养至A6 0 0nm 为 0 .5～ 0 .6时 ,诱导表达 5h ,rhANG表达量最高达 30 %。重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高rhANG的表达量 ,为发酵规模的扩大奠定了基础     

重组人白细胞介素-18的高浓度复性、纯化和活性检测

目的摸索大规模生产重组人白细胞介素 18(rhIL 18)高效简便、成本低廉的生产工艺。优化rhIL 18高浓度下最优复性、纯化方案 ,建立快速准确的活性检测方法。方法采用液相色谱和光谱学方法检测复性效率 ,筛选确定rhIL 18最优复性条件 ,再用SepheroseFFANX阴离子交换柱结合分子筛HiPrepSephacrylS 10 0进行纯化。采用3 H 掺入法检测rhIL 18产品对人外周血单个核细胞的促增殖作用 ,用流式细胞术检测其促γ 干扰素生成能力。结果建立了一套rhIL 18复性、纯化、活性检测方案。结论液相色谱和光谱学方法相结合 ,可用于检测rhIL 18的复性效率 ,流式细胞术也可用于检测rhIL 18的生物活性。     

考察尿素含量对重组人粒细胞刺激因子质量的影响

目的考察尿素含量对重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)质量的影响。方法将含量分别为98%,99.5%的尿素用于rhG-CSF的变复性工艺,并对制成的原液、半成品和成品,按照2005年版《中国药典》分别进行各项质量检测。结果用含量为98%和99.5%的尿素原材料所生产的3批产品的原液和成品,均符合2005年版《中国药典》rhG-CSF注射液的各项要求。结论尿素原材料中尿素含量只要达到≥98.0%的标准就可用于生产,不仅工艺稳定,而且还能降低成本。     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

半乳糖化重组人生长激素和重组人生长激素在小鼠体内的药物动力学

目的：比较半乳糖化重组人生长激素和重组人生长激素在小鼠体内的药物动力学特征。方法：用＾１２５Ｉ标记Ｇａｌ－ｒｈＧＨ和ｒｈＧＨ、通过小鼠尾静脉ｉｖ，测定血和肝中相对放射性随时间的变化，以３Ｐ８７药物动力学程序进行模型拟合和参数求算。结果：＾１２５Ｉ－ｒｈＧＨ－Ｇａｌ在血中的相对放射性呈现双峰，其体内药行动力学特征与＾１２５Ｉ－ｒｈＣＨ明显不同，进一步证实了Ｇａｌ－ｒｈＧＨ的肝靶向性。     

重组人红细胞生成素糖基化与生物活性关系的研究

目的　研究重组人红细胞生成素糖基化与生物活性的关系。方法　采用间苯二酚显色法测定rhEPO的唾液酸含量 ;网织红细胞法测定rhEPO的生物活性 ;并对二者进行相关性分析。结果　当唾液酸 EPO小于 8.2 8时 ,其生物比活性低于12 0 0 0 0IU mg。结论　重组人红细胞生成素的唾液酸含量高低与其生物比活性具有显著正相关性 (r=0 .64 92 79)。     

重组人血管抑素的表达、复性优化及活性研究

目的探索一种实效、经济的血管抑素制备工艺。方法对基因工程菌(E.coli,M15/pQE/AS)的IPTG诱导条件及包涵体复性纯化条件进行优化,产物以SDS-PAGE鉴定纯度,在人微血管内皮细胞模型及鸡胚尿囊膜模型上鉴定其生物学活性。结果经优化后重组人血管抑素的表达量约达菌体蛋白的30%,纯化的重组人血管抑素可显著抑制人微血管内皮细胞的增殖,最高抑制可达47%,并可显著抑制鸡胚尿囊膜模型上血管的生成。结论该表达、复性工艺简单,高效可行。     

重组人尿激酶原对恒河猴的长期毒性研究

目的:研究重组人尿激酶原(rhpro-UK)对恒河猴的长期毒性.方法:健康恒河猴分别按体质量随机分为低、中、高剂量组(3,10和30mg·kg-1)和空白对照组,每组6只,雌雄各半.iv给药,qd,连续14d,末次给药后处死一半动物做病理解剖,另一半停药后继续观察7d.观察症状和检测指标包括:①一般症状.②心电图.③凝血时间(CT)等血液学指标.④凝血酶时间(TT)等血液生化指标.⑤尿液检查.⑥抗体测定.⑦骨髓检查.⑧病理检查.结果:d14给药后采集的血样中,与d0或空白对照组相比,给药组的CT、TT、部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)明显延长、血浆纤维蛋白原含量(Fig)明显降低,且存在量效关系.d21采集的血样中,上述指标恢复正常.d14及d21病理组织学检查发现每组均有部分动物出现肝、肾淤血,轻度细胞水肿,可能系动物的隐性感染而非药物所致.d14高、中剂量组可见部分动物肺泡大片或灶性出血,注射部位静脉内膜增生或坏死、软组织出血、静脉炎及血管周围炎,d21给药组肺组织基本正常,注射部位皮肤的出血和炎症反应基本消失.结论:rhpro-UK对猴血液系统有一定的药理毒理作用,主要表现为使猴CT,TT,aPTT,PT时间延长,Fig含量降低,但这些毒性作用均是可逆的.rhpro-UK对猴的安全剂量为3mg·kg-1.