人结肠癌LS174T/5-Fu多药耐药细胞系的建立

目的 建立人结肠癌多药耐药细胞系,并研究其生物学特性.方法 以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为诱导药物,LS174T细胞株为研究对象,利用浓度递增诱导法,建立LS174T/5-Fu多药耐药细胞系.MTT法测定药物敏感性,光镜、细胞计数法、流式细胞仪及RT-PCR等方法观察其生物学特征及多药耐药相关基因(MRP)mRNA表达.结果 历时6个月成功建立人结肠癌多药耐药细胞系LS174T/5-Fu,对5-Fu耐药指数为40.24,且与羟基喜树碱、顺铂、依托泊苷和脱氧氟尿苷等多种化疗药物有不同程度的交叉耐药性;细胞形态发生改变;倍增时间较亲代细胞延长;细胞周期发现其G1和S期细胞增加,G2期细胞减少;MRP mRNA表达增高.结论 LS174T/5-Fu细胞是一种可靠的人结肠癌多药耐药细胞系,该细胞系的建立为深入研究5-Fu诱导人结肠癌多药耐药的发生机制奠定了基础.     

两种人大肠癌多药耐药株的建立及耐药性比较

目的比较递增药物质量浓度持续作用、恒定药物质量浓度周期作用两种方法建立的人大肠癌多药耐药细胞株的耐药性。方法用递增药物质量浓度持续作用、恒定药物质量浓度周期作用方式分别建立人大肠癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)多药耐药细胞亚系L2和L3,MTT检测两种细胞株的耐药指数,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因mRNA表达,Western blot检测p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。结果递增药物质量浓度持续作用法诱导8个月后,细胞可以在含2.5μg/mL 5-Fu的培养液中正常生长,对5-Fu的耐药指数为26.53,对该细胞亚系命名为L2;以含2.5μg/mL 5-Fu的培养液进行筛选,6个月后细胞能稳定生长,所得细胞亚系命名为L3,其对5-Fu的耐药指数为13.78。与L2相比,G1期细胞数量较少,细胞凋亡较多,MDR1 mRNA转录水平和P-gp表达相对较低。结论大肠癌LOVO细胞株经递增药物质量浓度持续作用、恒定药物质量浓度周期作用两种诱导方式作用后,成功建立的人大肠癌5-Fu多药耐药细胞亚系L2和L3均可产生MDR;其耐药机制可能与MDR1 mRNA和P-gp的过表达有关。两种方法建立的肿瘤多药耐药模型在耐药性上有一定差异。     

上皮-间质转化在人结肠癌细胞系SW480对西妥昔单抗及氟尿嘧啶耐药中的作用

目的探讨人结肠癌细胞系SW480上皮-间质转化现象与其在化疗药物及靶向药物耐药中的作用.方法西妥昔单抗(cetuximab,C225)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)以及二者联合处理人结肠癌细胞系SW480,观察细胞形态,免疫荧光化学方法检测处理前后SW480细胞骨架改变以及E-钙粘素(E-cardherin)、波形蛋白(vinmentin)表达差异,Western blot方法检测实验组与对照组SW480细胞E-cardherin、Vinmentin以及多药耐药蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)表达差异;体外药物敏感试验(cell Counting Kit-8,CCK-8比色法)分别检测实验组与对照组SW480细胞存活能力.结果 SW480细胞经C225、5-Fu以及二者联合处理后细胞形态由上皮细胞向间质细胞转化;细胞免疫荧光显示处理前后SW480细胞骨架改变,微丝蛋白排列极性增强,E-cardherin表达下降,Vinmentin表达升高,同时伴随MRP、P-gp表达增高.SW480细胞经C225与5-Fu联合处理较单独应用2个药物细胞存活率明显降低(P<0.05).结论 SW480细胞经单独使用靶向药物或化疗药物以及两者联合应用可诱导细胞发生EMT,且此EMT对肿瘤细胞耐药有影响.     

多药耐药细胞系A549/ADM的建立及部分特性

目的建立多药耐药细胞系A549/ADM和初步探讨人肺腺癌细胞多药耐药的发生。方法对肺腺癌细胞A549采用持续低浓度和逐渐增加阿霉素浓度间歇诱导,建立多药耐药细胞系;使用流式细胞仪器分别检测敏感细胞系和耐药系的P-gp和MRP的表达;采用MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度。结果与母细胞系相比,耐药细胞系A549/ADM对ADM的耐药程度增加了14.29倍,对VCR、DDP、VP-16均有不同程度的耐药,对5-FU无耐药性;耐药细胞系A549/ADM表面P-GP、MRP表达分别为74.8%和61.2%(P<0.01)。结论A549/ADM对多种常用肿瘤化疗药物表现有不同程度的耐药,其耐药性可能与P-GR和MRP高表达有关。     

人膀胱癌耐药细胞系T24/ADM的建立及其耐药机制

目的建立人膀胱癌耐药细胞系,对其耐药机制进行初步探讨。方法采用阿霉素浓度梯度递增诱导法,建立多药耐药细胞系T24/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,应用RT-PCR和Western blot比较两种细胞P-GP、MRP和LRP的表达差异来探讨可能的耐药机制。结果建立了T24/ADM耐药细胞系,对ADM、VCR和VP16有交叉耐药,P-GP、MRP和LRP在耐药细胞系中表达升高。结论 T24/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因表达升高是T24/ADM获得耐药的主要机制之一。     

醋酸甲羟孕酮对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:检测醋酸甲羟孕酮(MPA)对人结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响并初步分析其机制.方法:人结肠癌细胞LS174T体外培养,以不同浓度的MPA(12.5、25、50和100 μmol/L)进行干预120 h,MTT法测定其对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期、凋亡率和细胞表面Fas表达.结果:不同浓度MPA对结肠癌细胞具有显著的抑制作用. MPA处理后阻止G1期细胞向S期的进程,S期和G2/M期细胞相对减少.LS174T细胞的自然凋亡率为4.8%,12.5 μmol/L组细胞凋亡率为15.1%,25 μmol/L组细胞凋亡率为25.6%; MPA作用后结肠癌细胞表面Fas表达显著增强.结论:MPA对结肠癌细胞具有显著的抑制作用和诱导凋亡的作用,其机制可能与MPA使结肠癌细胞停滞于G1期及细胞表面Fas表达上调有关.     

藤龙补中汤对结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响

目的：观察藤龙补中汤对结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响。 方法：用不同浓度藤龙补中汤处理人结肠癌细胞LS174T和人结肠上皮细胞CRL-1790。用细胞计数检测试剂盒检测细胞增殖,平板法检测细胞克隆形成数目并计算抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,比色法检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8和caspase-9的活性。 结果：与对照组比较,藤龙补中汤对人结肠上皮细胞CRL-1790增殖无明显影响;1 mg/mL藤龙补中汤作用72 h,2 mg/mL藤龙补中汤作用48、72 h,5~20 mg/mL藤龙补中汤作用24~72 h均可显著抑制LS174T细胞增殖;1~20 mg/mL藤龙补中汤可显著抑制LS174T细胞克隆形成;5~20 mg/mL藤龙补中汤可诱导LS174T细胞凋亡,使LS174T细胞阻滞在G0/G1期,增强LS174T细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。 结论：藤龙补中汤可抑制结肠癌LS174T细胞增殖,阻滞LS174T细胞于G0/G1期,促进LS174T细胞凋亡;藤龙补中汤促LS174T细胞凋亡作用可能与增加caspase-3、caspase-8、caspase-9活性相关。     

HL60/VCR白血病细胞多药耐药机制的初步探讨

目的探讨白血病细胞产生耐药的机制,以及VEGF在白血病细胞产生耐药过程中的作用。方法采用反复暴露并逐渐提高诱导药物浓度的方法建立HL60/VCR多药耐药细胞系,MTT法检测细胞的耐药性及交叉耐药性;RT-PCR检测诱导前后mdr1、MRP、TopoⅡα、GSTπ和VEGF mRNA的表达情况。结果诱导后的HL60/VCR耐药细胞不仅对VCR高度耐药,对其他类化疗药物亦具有交叉耐药性;与HL60相比,HL60/VCR的mdr1、TopoⅡα和VEGF mRNA的表达明显增强,GSTπmRNA的表达无明显变化;HL60和HL60/VCR均不表达MRP mRNA。结论耐药基因mdr1和TopoⅡα以及VEGF共同参与HL60/VCR多药耐药的形成。     

干扰结肠癌上皮细胞Ascl2的表达致其向杯状细胞表型分化

目的探讨转录因子Ascl2对结肠癌细胞分化的影响。方法采用Ascl2分子干扰质粒和对照质粒对结肠癌HT-29和LS174T细胞进行转染,通过G418筛选建立稳定转染的细胞系,采用RT-PCR和Western blot方法检测干扰Ascl2分子表达对肠杯状细胞标志物Muc2和TFF3表达的影响。结果成功构建了shRNA-Ascl2/EGFP质粒以及对照质粒shRNA-control/EGFP,经测序与预期相符,G418筛选获得shRNA-Ascl2/HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T稳定转染细胞。RT-PCR和Western blot检测证实干扰质粒能够有效地抑制HT-29和LS174T细胞内的Ascl2的表达(P<0.01)。RT-PCR检测发现Muc2和TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的HT-29细胞内均明显上调(P<0.05);Muc2 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T细胞内明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),但是TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T内升高不明显(P>0.05)。Western blot检测发现Muc2蛋白质表达水平在Ascl2干扰后明显上调(P<0.05)。结论干扰结肠癌HT-29和LS174T细胞内Ascl2的表达导致其向杯状细胞的表型分化。     

卵巢癌顺铂耐药细胞系建立及部分耐药基因的表达

目的建立卵巢癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞系,并比较耐药与非耐药卵巢癌细胞系之间部分耐药相关基因的表达差异。方法采用浓度梯度递增法建立人卵巢癌DDP耐药细胞系SKOV-3/DDP。验证其有关的生物学指标;并用免疫组化法及RT-PCR技术检测耐药与非耐药卵巢癌细胞系之间P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及部分耐药相关基因的表达差异。结果耐药细胞系对DDP、氟尿嘧啶(fluorouracil)和多柔比星(doxorubicin)的耐药指数(RI)分别为13.94、10.83、4.52;细胞周期比例SKOV-3/DDP细胞系G0/G1期细胞明显少于SKOV-3细胞系(P<0.01),S期、G2/M期细胞明显多于SKOV-3细胞系(P<0.01);P-糖蛋白(P-gp)阳性细胞率SKOV-3/DDP细胞系为65%±5%;SKOV-3细胞系为6%±2%,两者差异极显著(P<0.001)。在检测的耐药相关基因中MDR1、Sur-vivin在SKOV-3/DDP细胞系呈阳性表达,在SKOV-3细胞系未表达;TopoⅡβ表达情况与此相反。结论顺铂诱导的卵巢癌细胞耐药可对其他不同作用机制的药物产生交叉耐药,多药耐药涉及多个相关基因的表达,说明耐药的发生是一个多途径的复杂过程。     

人胰腺癌耐药细胞株Patu8988/5-Fu的建立及其耐药机制的初步探讨

目的:建立人胰腺癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药细胞株Patu8988/5-Fu,观察其生物学特性并初步探讨其耐药机制.方法:采用5-Fu体外低浓度梯度递增联合大剂量冲击诱导法诱导培养人胰腺癌细胞株Patu8988,10个月建立获得性Patu8988/5-Fu多药耐药细胞株,光镜观察形态学变化;MTT法分析Patu898...     

阿霉素诱导大肠癌LoVo细胞产生多药耐药中端粒酶逆转录酶的变化

目的:观察在阿霉素诱导大肠癌LoVo细胞产生多药耐药过程中,端粒酶逆转录酶基因表达,明确端粒酶是否参与了多药耐药机制. 方法:采用阿霉素浓度递增法,建立人大肠癌细胞多药耐药模型LoVo/Adr;用MTT法鉴定耐药LoVo/Adr细胞的耐药性;以流式细胞术检测其周期分布;用RT-PCR方法检测hTERT mRNA水平在诱导耐药过程中的变化. 结果:历经8 mo 、传代67次连续培养,建立了人大肠癌耐药模型LoVo/Adr细胞株;LoVo/Adr对阿霉素、长春新碱、丝裂霉素、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶耐药倍数分别是61倍、14倍、3倍、9倍和1倍;LoVo/Adr细胞与LoVo细胞相比,S期细胞减少,而G1, G2期增多;亲本LoVo细胞的hTERT mRNA呈低水平表达,在阿霉素诱导初期即显著增高,随后基本保持高表达状态,并不随着耐药性增加而增强. 结论:耐药株LoVo/Adr是一个典型的具有多药耐药性表型的耐药模型,端粒酶参与了其耐药机制.     

人结肠癌细胞HCT-8/V及HCT-8中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达

目的:观察人结肠癌HCT-8细胞和其耐药细胞株HCT-8/V中葡萄糖神经酰胺合成酶(CCS)的表达及意义.方法:体外培养HCT-8细胞和HCT-8/V,采用CCK8法检测2种细胞对长春新碱(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)及顺铂(DDP)的耐药性,计算IC50.采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测2种细胞中GCS蛋...     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

目的 通过建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对顺铂的耐药机制。方法应用顺铂连续作用并逐步提高药量的递增压力选择法，从人卵巢腺癌细胞ＣＯＣ１中分离出对顺铂耐药的细胞亚株（ＣＯＣ１／ＤＤＰ），并比较耐药细胞和亲代细胞某些生物学特性差异。结果ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂的耐药性是ＣＯＣ１的６．５倍，群体倍增时间较亲代细胞缩短了１２．９％。对卡铂和丝裂霉素Ｃ有不同程度的交叉耐药性，对阿霉素和５－氟尿嘧啶则保持敏感。并且耐药细胞内铂离子含量及ＤＮＡ链间交联指数均明显低于ＣＯＣ１细胞，但免疫细胞化学显示ＣＯＣ１及ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞内均无Ｐ糖蛋白表达。结论ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂耐药的主要原因是细胞内药物浓度降低及ＤＮＡ链间交联形成减少，与Ｐ糖蛋白关系不大。     

5-氟尿嘧啶对大肠癌Fas蛋白表达的调控作用

目的：探讨5-氟尿嘧啶（5-Fu）对大肠癌细胞Fas蛋白表达水平的调控作用。方法：采用流式细胞术检测了培养的9株细胞（6株为大肠癌细胞）Fas蛋白的表达情况,并观察了5-Fu（260mol/L）处理后大肠癌细胞Fas蛋白表达水平的变化。结果：在检测的6株人大肠癌细胞中,有5株肿瘤细胞表面表达Fas蛋白;用临床浓度的5-Fu处理后,HCT-116和WiDr的Fas蛋白的表达水平显上调。结论：5-Fu可上调肿瘤细胞Fas表达水平,由此可能增加其对Fas介导的机体免疫监视作用的敏感性。     

1-甲基乙内酰脲与氟尿嘧啶联合对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡作用的研究

目的探讨1-甲基乙内酰脲(1-methylhydantoin)单用以及与氟尿嘧啶(5-Fu)联合对结肠癌SW480细胞增殖抑制作用和诱导凋亡。方法使用MTT比色法检测1-甲基乙内酰脲M_((a-h))在不同浓度(0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L)单用及与不同浓度5-Fu_((a-d))(10、20、50、100 mg/L)联合作用于人结肠癌SW480细胞的吸光度值,然后再计算抑制率(IR)。流式细胞仪监测M_d、M_e、Fu_b、M_d+Fu_b、M_e+Fu_b处理SW480细胞48 h对细胞周期分布和凋亡影响。结果 1-甲基乙内酰脲在体外对人结肠癌SW480细胞有增殖抑制作用。在低浓度时,1-甲基乙内酰脲对人结肠癌SW480细胞增殖抑制效果与5-Fu相当(P0.05);在高浓度时,1-甲基乙内酰脲对人结肠癌SW480细胞抑制增殖效果弱于5-Fu(P0.05)。1-甲基乙内酰脲与氟尿嘧啶联合应用有协同抗肿瘤效果。结论 1-甲基乙内酰脲能够抑制人结肠癌细胞SW480的增殖和诱导凋亡作用,并与氟尿嘧啶有协同抗瘤细胞增殖效果。     

苍术素对人结肠癌LS174T细胞增殖的影响

目的: 探讨苍术素(atractylodin)对人结肠腺癌LS174T细胞增殖的影响。方法: 将人结肠癌LS174T细胞分为空白对照组、无水乙醇对照组、苍术素处理组(10,20,40,80 mg/L)。将梯次浓度苍术素作用于LS174T细胞后,分别培养24、48、72、96 h;采用倒置显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测细胞生长状况;流式细胞仪检测细胞周期变化;液相芯片法检测细胞因子分泌的改变。结果： 作用24 h后,20,40,80 mg/L组苍术素抑制LS174T细胞增殖,且抑制作用呈时间和浓度依赖性;流式细胞术结果可见经苍术素处理后,G0/G1期细胞比例增加;液相芯片检测结果显示苍术素可抑制LS174T细胞分泌IL-6和IL-7。结论： 苍术素抑制LS174T细胞增殖,其机制可能是影响细胞因子分泌和阻断细胞周期。     

人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株的建立及其生物学特性观察

目的:建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。方法:采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法建立5-FU获得性BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株。MTT法检测耐药细胞株对多种化疗药物的交叉耐药性。观察其细胞形态学、生长曲线、倍增时间、平板克隆形成率、贴壁率、细胞周期分布、染色体核型以及裸鼠致瘤性。流式细胞术检测阿霉素在亲本及耐药细胞株内的积聚量。免疫细胞化学法检测胸苷酸合酶在耐药细胞内的表达。结果:成功建立人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株模型。该耐药细胞对阿霉素、长春新碱、奥沙利铂及甲氨蝶呤均有不同程度的交叉耐药性,但对羟基喜树碱仍较敏感。体外培养见细胞趋向群集性生长。耐药细胞株倍增时间较亲本细胞株长,克隆形成率则较亲本细胞株低,差异有统计学意义。耐药细胞贴壁率在23、h明显低于亲本细胞株,其G0/G1期细胞分布比率较低而S期比率明显增加。阿霉素在耐药细胞株内的积聚量低于亲本细胞株,耐药细胞株胸苷酸合酶的蛋白表达量较亲本细胞株明显增强。结论:人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞株可以成为研究5-FU获得性耐药机制及开展多药耐药逆转剂筛选较好的体外模型。