构建RNA干扰载体特异性抑制绿色荧光蛋白表达的研究

目的:利用PCR构建RNA干扰质粒载体的方法,促进RNA干扰技术的广泛开展.方法:PCR方法获得小鼠U6 27启动子序列,以及干扰绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA的相应DNA模板序列.将其序列克隆入pUC19,获得RNA干扰载体pU6-siEGFP.将pU6-siEGFP及pcDNA3.1/EGFP共转导COS-7细胞,观察EGFP表达情况.结果:所构建的pU6-siEGFP能够成功干扰COS-7细胞中EGFP的表达.结论:PCR方法成功构建了RNA干扰载体,为RNA干扰技术在更多实验室的广泛开展奠定基础.     

RNA干扰技术抑制肺癌细胞外源性绿色荧光蛋白的表达

目的：构建针对绿色荧光蛋白（GFP）基因的发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）表达载体（pshRNA-GFP）,观察对肺癌A549细胞的GFP特异性抑制作用。方法：设计针对GFP基因的shRNA序列,构建pshRNA-GFP质粒。与报告基因质粒PEGFP-N1共转染A549细胞,分别用激光共聚焦扫描显微镜（Laser confocal seanning mieroscope,LCSM）和流式细胞术检测干扰效果。结果：瞬时共转染pshRNA-GFP质粒和PEGFP-N1质粒后,荧光显微镜观察结果显示A549细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至32.4％,差异有显著性。结论：靶向GFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制GFP在A549中的表达,A549细胞中存在RNA干扰现象。     

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的：探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用，建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法：构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒，转染A549肺肿瘤细胞，观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果：针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达，并当比例为1：1时效果最佳，而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论：以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段，并且为研究基因功能的一条有效途径。     

小干扰RNA体外抑制HBs-GFP融合基因的表达

目的:利用增强型绿荧光蛋白(EGFP)和小发夹RNA(shRNA)表达载体技术,建立一种行之有效且相对经济的验证siRNA的方法.方法:将HBV S基因融合到EGFP中,建立HBs-GFP融合基因表达载体;同时构建带U6 27 RNA转录启动子的shRNA表达载体pAVU6 4sh357.二载体共转染HepG2细胞后,流式细胞仪检测HBs-GFP蛋白的荧光强度;同时RT-PCR和实时定量PCR法检测HBs-GFP mRNA水平的改变.结果:小干扰RNA有效抑制目的基因的表达,共转染后第72 h荧光蛋白抑制率为55.4%;HBs-GFP 融合基因的RNA表达受到显著抑制,抑制率达到90%.结论:载体法表达的小干扰RNA体外显著抑制HBs-GFP融合基因的表达.     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。     

Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法.方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果.结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好.结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段.     

RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达

目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHV)序列特异性siRNA对WHV X基因表达的抑制作用。方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHV X基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3H-WHx);合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2);质粒pXF3H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达。结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90%以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失。结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达。     

RNA干扰抑制胸膜间皮细胞水通道蛋白1表达的实验研究

目的 研究RNA干扰技术对大鼠胸膜间皮细胞水通道蛋白1（AQP1）基因表达的影响,探讨应用该技术治疗胸腔积液的可行性。方法体外培养大鼠胸膜间皮细胞,细胞鉴定后,采用免疫细胞化学、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测AQP1表达;设计并构建2个靶向大鼠AQP1基因的短发夹RNA（shRNA）重组质粒,脂质体转染大鼠胸膜间皮细胞48h后,采用RT—PCR及Western印迹方法分别在mRNA和蛋白质水平检测AQP1基因表达的抑制效果。结果胸膜间皮细胞存在AQP1表达,所设计的2个AQP1-siRNA重组质粒可不同程度地抑制AQP1在胸膜间皮细胞中的表达,在mRNA水平抑制率分别为83．5％和90．9％;在蛋白质水平抑制率分别为41．2％和67．6％,与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义（P〈0．01）。结论质粒介导的RNA干扰可明显抑制大鼠胸膜间皮细胞AQP1基因的表达,且抑制率具有序列相关性,是潜在的胸腔积液基因治疗新方法。     

RNA干扰技术抑制鼻咽癌细胞内源性绿色荧光蛋白的表达

目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的鼻咽癌细胞株;观察不同转染浓度的短发卡状RNA对鼻咽癌细胞内源性GFP的抑制效率及细胞毒性.方法:转染pEGFP-N1至鼻咽癌细胞株HNE1,G418筛选获得稳定表达GFP的HNE1-GFP细胞株;利用针对GFP基因的短发卡状RNA表达载体shGFP,以不同浓度shGFP转染HNE1-GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,软件分析荧光抑制效率,MTT检测细胞毒性,RT-PCR检测GFPmRNA水平改变,Western Blot检测GFP蛋白水平改变.结果:绿色荧光稳定表达于传代HNE1细胞中;shGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达,抑制效率分别为49.7%,84.8%,86.7%且无细胞毒性;GFP在mRNA和蛋白水平的表达均有明显下降.结论:稳定表达GFP的鼻咽癌细胞株成功建立;RNA干扰载体可抑制鼻咽癌细胞中GFP的表达,其抑制效率有明显的浓度依赖性且无明显细胞毒性.该系统能够用于鼻咽肿瘤的RNA干扰机制研究中.     

小干扰RNA特异性抑制淋巴细胞T-bet表达的研究

目的 探讨体外转录法合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人淋巴细胞T-bet基因表达及功能的影响.方法 设计并合成4条siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及siRNA-co),脂质体法转染淋巴细胞.转染后48 h收集转染后细胞,采用RT-PCR方法检测细胞T-bet mRNA的抑制率;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞上清液中IL-4和IFN-γ水平;将淋巴细胞与人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)共培养检测淋巴细胞对ECV304增殖的抑制作用.结果 转染后48h半定量RT-PCR的检测显示siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3转染后的淋巴细胞T-bet表达抑制率分别为(72.50±1.01)%、(5.40±0.63)%和(30.90±0.90)%,以siRNA-1转染后的淋巴细胞T-bet表达抑制作用最强(P＜0.05),其细胞上清液中IL-4水平最高,而IFN-γ的水平最低(P＜0.05),siRNA-1转染淋巴细胞对人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)增殖的抑制作用低于siRNA-2及siRNA-3.结论 siRNA可特异性抑制淋巴细胞T-bet基因的表达,从而为进一步研究siRNA在移植免疫耐受中应用提供了理论和实验基础.     

人类内皮活化相关新基因EOLA1真核表达载体的构建与鉴定

目的 为筛选与新基因EOLA1（内皮高表达脂多糖相关因子1）相互作用蛋白，了解EOLA1基因功能奠定基础。方法 应用菌液PCR技术，从贮存的含EOLA1基因全长cDNA的大肠杆菌DHSa中扩增其开放阅读框（ORF）序列，亚克隆到真核表达载体pGBKT7中，经酶切及测序进行验证。结果 鉴定结果显示，EOLA1的ORF全部序列包含在所构建质粒的多克隆位点中，且序列比对完全相同，表明EOLA1真核表达载体构建成功。结论 EOLA1基因真核表达载体的成功构建为进行蛋白质相互作用研究提供了有力的工具。     

人新基因EOLA1生物信息学分析

目的预测人类新基因EOLA1的生物学功能。方法基于EOLA1全长cDNA序列,应用生物信息方法,从序列比对、染色体定位、基因结构分析、编码蛋白理化性质分析、蛋白质位点和序列模式预测等几个方面对EOLA1进行分析。结果EOLA1编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白;EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源,到目前为止,对鼠111002L19蛋白功能也不清楚;应用辐射杂交细胞系（RH）作图系统发现EOLA1定位于Xq27．4;对其二级结构进行预测发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点以及1个螺旋-转角-螺旋（HTH）基序。结论人新基因EOLA1编码蛋白质的一级和二级结构特征赋予EOLA1信号转导能力,有可能作为信号分子在LIDS激活人血管内皮细胞的过程中发挥作用。     

eola1下调表达对ECV304细胞增殖的影响

目的设计和构建人类新基因人内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelium-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor1, eola1)特异性的小干扰RNA表达载体sieola1,建立eola1下调表达模型,观察eola1下调表达对细胞增殖的影响.方法设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ-HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上;转染重组质粒到ECV304细胞,通过定量RT-PCR实验检测靶基因的抑制情况;对转染sieola1质粒的细胞进行细胞计数,并应用流式细胞仪观察细胞周期的变化.结果构建的小RNA干扰质粒sieola1转染ECV304细胞能够抑制靶基因eola1的表达;细胞计数和流式细胞仪检测结果显示eola1表达抑制后,细胞生长周期延长.结论成功构建了针对eola1基因的siRNA质粒;细胞计数和流式细胞仪检测结果初步确认eola1具有抑制ECV304细胞增殖的作用.     

siRNA沉默CXCR4基因的实验研究

目的:设计和构建趋化因子受体4(CXCR4)基因的小干扰RNA质粒,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法:选择高表达CXCR4受体的人乳腺癌细胞系T47D作为研究对象。将预先设计的3段siRNA分别连入质粒载体,然后转化大肠杆菌,经过克隆、扩增、纯化后转染到T47D细胞中,G418筛选稳定表达细胞株,采用流式细胞术从蛋白水平检测CXCR4的表达率,实时定量PCR从基因转录水平检测CXCR4基因的表达率。结果:流式细胞术检测结果显示,T47D细胞经特异性siRNA作用后CXCR4的表达率由69.00%分别下降到4.95%、11.30%、5.53%。实时相对定量PCR检测结果显示,siRNA作用的细胞其CXCR4基因转录的抑制率分别为95.67%、85.94%、98.25%。结论:siRNA能够引发人乳腺癌细胞系T47D的CXCR4基因沉默,为进一步探讨CXCR4基因在乳腺癌转移中的作用奠定前期实验基础,也为siRNA作为一种可能的治疗手段提供了理论依据。     

EOLA1与MT2A相互作用及其上下游关系的确定

目的 研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)与金属硫蛋白2A(MT2A)的相互作用关系,明确其相互作用位点及上下游关系.方法 构建EGFP-EOLA1融合表达载体,转染HUVEC细胞,应用免疫荧光共定位成像技术观察EOLA1和MT2A在HUVEC中的共定位情况;应用截短突变和酵母双杂交确定EOLA1和MT2A的相互作用位置;应用RNAi技术建立EOLA1/MT2A上调和下调的HUVEC细胞模型,观测模型细胞EOLA1/MT2A的表达情况.结果 EOLA1和MT2A在HUVEC中存在共定位现象,共定位主要发生在核膜周围;酵母双杂交和免疫共沉淀实验结果显示,EOLA1的截短突变体1～77氨基酸(aa)片段和MT2A无结合活性,1～115aa片段及1～158aa片段和MT2A有结合活性.EOLA1上调/下调表达时MT2A同时相应上调/下调表达,MT2A的上调和下调表达对EOLA1表达无明显影响.结论 EOLA1和MT2A在HUVEC细胞内存在相互作用,相互作用位点位于EOLA1ORF的100～113功能域,EOLA1可以调控MT2A在HUVEC中的表达.     

姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响

目的:探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响。方法:采用MTT法,台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系,Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用;通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2 mRNA表达,明胶酶谱法检测MMP-2的活性,免疫组化检测细胞MMP-2表达。结果:姜黄素对ECV304的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性,Giemsa染色显示浓度为8μg/mL和10μg/mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡,凋亡率分别是21.6%和34.7%;在10μg/mL姜黄素作用24 h下,MMP-2的mRNA显著减少,其分解明胶的活性也显著降低,免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少。结论:姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达。     

hEOLA1抗体的制备及肿瘤组织中EOLA1的表达检测

目的 制备抗EOLA1多克隆抗体并检测其在肿瘤组织中的表达.方法 采用原核表达获得EOLA1蛋白,纯化后作为抗原免疫大白兔,获得兔抗人EOLA1(hEOLA1)多抗血清.进行免疫组化检测人多肿瘤芯片上EOLA1的表达.结果 制备了高滴度的hEOLA1多克隆抗体,免疫组化显示EOLA1蛋白在肺癌、结肠癌、胃癌和肝癌仅表达于肿瘤问质.肿瘤细胞本身未见表达,而在胶质瘤和乳腺癌则早广泛表达.结论 EOLA1可能在胶质瘤和乳腺癌的发生、发展方面起着重要作用.     

脱氢表雄酮对内皮细胞NO,ET-1生成及ICAM-1表达的影响

目的:观察脱氢表雄酮对内皮细胞NO合成、ET-1分泌及细胞表面ICAM-1表达的影响.方法:培养的人脐静脉内皮细胞系ECV304经不同浓度和不同作用时间DHEA处理后,采用硝酸还原酶及放免法分别测定培养液中NO及ET-1水平,用SABC免疫组化法观察细胞表面ICAM-1的表达.结果:与对照组相比,随着DHEA浓度的增加,培养液中NO的含量从(387±12)降至(242±11)μmol/L(P<0.05),而ET-1的浓度却从(397±13)增至(626±29)ng/L(P<0.05).随着时间的延长,各对照组培养液中NO含量均无明显变化(P>0.05),而DHEA组NO生成量却逐渐降低(P<0.05),呈时间依赖.培养液中ET-1浓度无论是对照组还是DHEA组均随时间的延长而升高(P<0.05),但DHEA组升高的更为明显.无论是增加浓度还是延长时间,DHEA均不影响细胞表面ICAM-1的表达.结论:DHEA可通过调节内皮细胞NO及ET-1生成量对血管功能进行调控.     

内皮活化相关新基因EOLA1的体外表达及亚细胞定位

目的　研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子 1(Endothelial over expressedlipopolysaccharide associatedfactor 1,EOLA1)基因的体外表达和亚细胞定位 ,为进一步功能研究打下基础。方法　通过偶联转录 翻译系统体外表达EOLA1蛋白 ,并用变性凝胶电泳进行产物检测 ;构建EOLA1 EGFP(绿色荧光蛋白 )融合蛋白表达质粒 ,转染内皮细胞后瞬时表达 ,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位。结果　体外表达的EOLA1蛋白分子量约 18× 10 3,与预测结果相符合 ;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆 ,少量表达于细胞核。结论　EOLA1属细胞内结构蛋白 ,可能是参与了炎症时细胞内信号转导。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.