通过原生质体融合获得青霉素高产菌株

采用两株分别带有不同抗药性标记的产黄青霉原生质体以1:1相混合,用30％的聚乙二醇(MW6000)原生质体融合处理。将混和物涂布在补给有两种药物同时存在的高渗性分离培养基上,培养后获得异核体菌落。洗下异核体分生孢于继续分离在补给有两种药物同时存在的分离培养基上,得到了同时带有两种抗性标记的重组体。纯化后,进行抗性稳定性和摇瓶效价的测定,将一株具有双重抗性、摇瓶发酵效价较高的菌株作出发菌株,经诱变因子处理后,获得了一株43u7c—57菌株,在摇瓶中效价比生产菌株平均提高4.94％,该菌株在40吨发酵罐试生产后,发酵效价平均提高4.4％,产量则平均增加12.15％。     

顶头孢霉229与12的分生孢子及原生质体的形成和再生

头孢菌素产生菌顶头孢霉菌株229的沉没培养或斜面培养都可形成分生孢子,并可用普通滤纸将它们与菌丝及节孢子分开,但是它们成活率极低.这种成活的分生孢子的数量与培养基成分有关.菌丝培养基成分对制备顶头孢霉原生质体有显著影响.用一种MM培养基培养的菌丝,不经巯基化合物预处理,酶解(1%纤维素酶)3小时后,可得到大量原生质体.原生质体的再生频率为1.8～4.6%.与分生孢子形成的菌落相比,原生质体再生菌落的产抗生素能力显示出较大的变异性.本文还讨论了山梨醇与Nikkomycin对菌丝生长形态及原生质体形成的影响.     

顶头孢霉菌原生质体融合研究

顶头孢霉菌营养缺陷型菌株的原生质体是采用1％东风纤维素酶或0.1％Zymolyase5000消化生长48小时经0.005 M二硫苏糖醇(DTT)预处理的菌丝获得的。影响营养缺陷型菌株原生质体分离和再生的因素有不同来源的商品酶、不同批号的东风纤维素酶、菌丝生理状态、裂解温度、渗透压稳定剂浓度、再生培养基成份和培养条件等。含0.01 M CaCl_2的聚乙二醇(分子量6000),pH 8溶液作融合剂,融合率较高。营养互补的原生质体融合形成平衡异核     

麦迪霉素产生菌—生米卡链霉菌原生质体融合的研究

用甘氨酸—溶菌酶方法成功地分离生米卡链要菌(S.mycarofaciens)原生质体。在MgSO_4加倍的完全培养基(cm)上,原生质体再生频率远远超过R_2再生培养基。用3.68％的CaCl_2溶液,配制成30％(w/v)的PEG4000或6000溶液,可有效地诱导生米卡链霉菌原生质体融合,融合重组频率10~(-2)～10~(-3)。融合重组体和亲本在菌落形态、孢子形态和抗生素产量上有显著差异,不同的融合重组体之间,也表现了这些差异。实验分离到抗生素生产能力超过亲本40％的C_(69)菌株,经紫外光诱变后,又获得抗生素能力超过亲本15％(均以两亲本的平均值计)以上的C_(64112)菌株。融合重组体对紫外光的敏感度低于亲本,而抗生素生产能力的正变频率超过亲本。     

红霉素链霉菌原生质体的形成和再生及其对紫外光的敏感性

红霉素链霉菌的菌丝生长在含有0.8％甘氨酸的S培养基中,对溶菌酶的作用敏感,通过酶解,并利用一个包含10mM-MgCl_2和25mM-CaCl_2的高渗培养基能使其菌丝脱壁形成10~(10)/ml的原生质体。 原生质体能再生细胞壁,回复成为一个完整的细胞。最佳条件时再生频率达90％左右。 利用紫外光对红霉素链霉菌的孢子及原生质体分别照射3分钟,其致死率分别为97.95％和98.81％。     

东方诺卡氏菌原生质体的再生

现在不同微生物原生质体已成功地应用于菌株的重组,其成功与否很大程度上决定于原生质体再生的频率.作者以万古霉素产生菌——东方诺卡氏菌(Nocadia orientals)ATCC19795的原生质体为对象研究血清白蛋白对再生的作用,结果表明,再生频率决定于原生质体接种条件及培养基去水的程     

对渗透压不稳定的链霉菌用常规脱水再生平板会使原生质体再生频率大幅度下降

影响链霉菌原生质体再生频率有三大要素,即菌丝生长期,菌丝和原生质体再生培养温度、再生平板的脱水率和培养基成份。60-1与74-4为在南朝鲜土壤中分离得到的二株抗生素产生菌,用经典的岡西昌则和汤普逊的各种方法不能使其原生质体再生?匝榈?0-1株菌丝培养基应为TSB(Difco)加甘氨酸0.7%,28℃培养45小时;74-4株亦     

通过原生质体再生手段改进大环内酯类抗生素产生菌

三株大环内酯类抗生素产生菌:产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)产生螺旋霉素(Spiramycin),弗氏链霉菌(Strep-tomyces fradiae)产生泰乐菌素(tylosin),卷须链霉菌(Streptomyces cirratur)产生缠霉素。这三株菌株当用溶菌酶处理时,在高渗培养基中很容易形成原生质体。若在再生培养基中添补原生质扩张剂,则三种原生质体再生形成菌丝体的频率可达90～100%。     

巴比妥对地中海拟无枝酸菌的生长毒性及其与利福霉素B超产的关系

发展了一种筛选利福霉素Ｂ超产菌株的新方法。加有甘氨酸和巴比妥的合成培养基用诱变过的菌丝接种,培养 ４８ｈ后用溶菌酶处理。耐溶菌酶的菌丝用稀洗涤剂洗涤后种入含甘氨酸但不含巴比妥的合成培养基。所获得的原生质体再生后从中挑选菌落接种在加和不加巴比妥的Ｂｅｎｎｅｔ琼脂平板上。所挑选出的２株突变株对０．５％巴比妥敏感,其利福霉素产量比亲株高１倍。此外还分离出３０株耐巴比妥的突变株,但其产量均低于亲株。据此认为巴比妥对次级代谢（产生利福霉素）的影响与它对初级代谢的影响有关。     

巴比妥对地中海拟无枝酸菌的生长毒性及其与利福霉素B超？…

发展了一种筛选利福霉素Ｂ超产菌株的新方法。加有甘氨酸和巴比妥的合成培养基用诱变过的菌丝接种,培养４８ｈ后用溶菌酶处理,而溶菌酶的菌丝用稀洗涤剂洗涤后种入含甘氨酸但不含巴比妥的合成培养基。所获得的原生质体再生后从中挑选菌落接种在加和不加巴比妥的Ｂｅｎｎｅｔ琼脂平析上,所挑选出的２株突变株对０．５％巴比妥敏感,其利福霉素产量比新株高１倍。引外还分离同３０株耐巴比妥的突变株,但其产量均低于亲株。据此认为     

小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌突变菌株原生质体形成、再生及融合的研究

甘氨酸（Ｇｌｙ）的加入将会影响棘孢小单孢突变型菌株孢子发芽和菌丝生长，其影响程度与甘氨酸浓度及菌丝培养基成份有关，在Ⅱ号培养基中，０．３％Ｇｌｙ对菌丝形态的改变十分明显，而０．５％Ｇｌｙ能抑制孢子发芽。消色肽酶（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｉｔｉｄａｓｅ）与溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）联合作用比单一溶菌酶制备的原生质体形成率和再生率有明显提高。再生培养基以原分离培养基补充０．２ｍｏｌ／Ｌ蔗糖为宜，其再生频率可达到１５％。采用ＰＥＧ４０００，４２％（ｗ／ｖ）为助融剂，直接法检出融合重组体，其重组频率可达０．５％～１．０％，重组体中大部分苗株的次级代谢特性与亲株有较大差异，在再生菌落筛选中获得一些优良菌株，其小诺霉素产率较原亲株有显著提高。     

红霉素链霉菌重组子获得及其性状的初步研究

红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 两株不同营养缺陷型突变体(P_1~(cys~-)和M_1~(his~1))配对重组。重组频率为1.1×10~(-6)。重组子的生长速度,气生菌丝形态以及菌落形态等性状介于两亲本之间,除此之外,重组子对诱变剂(u v)很敏感,在蛋白胨完全培养基上形成红棕色色素,这两点是不同于亲本的新性状。重组子摇瓶效价接近于高单位亲本7—56水平,但只经两次诱变剂处理之后,获得DES-P_1M_1菌株,其摇瓶效价比高单位亲本7—56高25％左右。     

金色链霉菌原生质体电融合

为了提高去甲基金霉素的发酵效价,将金霉素链霉菌产生去甲基金霉素的变株的原生质体与金霉素高产变株热灭活的原生质体,用非交流电场法和交流电场法进行了电融合。在非交流电场法实验中。先用25％PEG将原生质体聚集,再以BAEKON 2000和SDⅡ型二种基因转移仪,采用几种不同的实验参数(脉冲强度、宽度和个数)进行融合,皆未能提高融合频率。交流电场法融合实验用SD3000细胞融合仪,当原生质体在交流电场(频率0.5MHz,强度800v/cm,作用时间60s)中形成串珠状后,施加直流脉冲(脉冲强度7kv/cm,宽度20μs,间隔0.5s,个数3),融合频率为2×10~(-4)左右,比50％PEG诱导的融合频率(2.5×10~(-5)高约一个数量级。对225株融合子进行了初筛发酵和效价测定。结果表明,其中效价高菌株所占百分数高于对照组(去甲基金霉素产生菌不同营养缺陷型的融合子),而且85％以上的融合子只产生去甲基组分。尽管融合子的发酵效价皆不稳定,但经过几次自然分离后仍获得了产量比出发菌株提高一倍左右并只产生去甲基组分较为稳定的融合子菌株。     

利用原生质体诱变筛选L—异亮氨酸高产菌株

在棒杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基,L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%,原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心直接涂皿的再生率为81.2%.A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株在L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

利用原生质体诱变筛选L-异亮氨酸高产菌株

在捧杆菌原生质体制备中,以单一甘氨酸代替青霉素与溶菌酶进行细胞脱壁处理,以含0.3M蔗糖的普通肉汤培养基作为再生培养基。L-异亮氨酸产生菌A6在肉汤中培养至对数期,加入0.3M蔗糖和3%甘氨酸,继续培养8h,原生质体的形成率达98%。原生质体经洗涤后的再生率为81.6%,不经离心洗涤直接涂皿的再生率为81.2%。A6菌株的原生质体经紫外线诱变处理后,再生菌株的L-异亮氨酸产量高达14.3mg/ml,比原菌株产量提高30%左右。     

壮观链霉菌原生质体融合研究

壮观放线菌素产生菌 Streptomycesspectabilis 2233经紫外线诱变获得的营养缺陷型菌株 SS 612(thr~-)和 SS 624(his~-),采用溶菌酶脱壁形成原生质体后,进行种内融合。以营养缺陷作为选择标记,获得了大量异养型及原养型重组子。融合频率达15%。重组子遗传分析表明,异养型和原养型重组子数量大致相等。但异养型重组子的双重营     

一种改进卡特利链霉菌358原生质体再生的方法

以卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ）３５８为原始菌株,研究了影响原生质体形成和再生的各种因素,证实了再生培养基中含ＨＥＰＥＳ缓冲剂以及Ｐ缓冲液中加入１％的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）后能有效地促进再生,在ＳＲ再生培养基上原生质体再生率由０．１％提高到２９．５％。     

金霉素链霉菌的半乳糖诱导菌落形态的解离作用

金霉素链霉菌(Str.aureofaciens)SA-1 菌株的孢子或营养菌丝悬浮液,于复合琼脂培养基或合成培养基上,产生许多黄色气生菌丝和白色菌落,不超过群体5%。当 SA-1菌株于含有半乳糖作单一碳源的无机盐培养     

柱晶白霉素产生菌的诱变育种和发酵研究

柱晶白霉素产生菌经常规诱变及原生质体多次再生处理，获菌株９１－９１１，其产量比原始菌株提高了３５倍以上；清除了原菌株的菌丝毒性；主组分Ａ５含量也有明显增加。为充分发挥９１－９１１菌株的生产潜力，采用均匀设计方法对发酵培养基进行优化，获得ｂ培养基。９１－９１１菌株用６培养基在２００Ｌ、１０ｔ规模发酵罐上试验，证实９１－９１１菌株确是一株高产稳产的优良生产菌种。     

赤霉素产生菌原生质体制备、纯化与再生工艺的研究

目的对赤霉素产生菌原生质体进行制备、纯化、再生工艺改进与完善。方法本文通过微孔滤膜作载体,在含甘氨酸的菌丝生长培养基固体平板上,培养取得幼嫩菌丝体,并对原生质体制备时的复合破壁酶液组分配比、酶解时间,原生质体纯化再生工艺进行了改进和完善。结果实验证明:①在幼嫩菌丝体的制备过程中,采用微孔滤膜平板法培养幼嫩菌丝体,易于控制菌龄,生长在微孔滤膜上的菌丝体不混杂有多余的培养基成份,不必经洗涤,可直接酶解,简化了实验步骤;②在原生质体制备过程中,采用以纤维素酶2%+蜗牛酶1%+果胶酶0.4%作为复合破壁酶液的组成,可使原生质体的释放量从105升至106;③在原生质体纯化过程中,采用先慢速离心沉淀,后洗涤滤除菌丝断片的操作方法,可使无壁娇嫩易碎的原生质体可依附菌丝断片作缓冲载体一起沉淀,有利于纯化收集到完整的原生质体,提高原生质体的活性再生;④在原生质体再生过程中,选用含有聚胨、酵母膏成份的RM再生培养基,可使原生质体的再生率达到16%以上。结论原生质体制备、纯化、再生工艺的改进与完善,确保了诱变育种基因突变后的遗传个体绝大部分都是纯合体,避免了高产性状经传代后水平回复的现象,为赤霉素理化诱变育种工作的顺利开展创造了良好条件。