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1.
重组人白细胞介素12基因在CHO—dhfr^—细胞的稳定表达 总被引:1,自引:0,他引:1
将分别含有重组人IL-12(rhIL-12)两个亚单位cDNA的真核细胞高效表达载体,通过Lipofectin介导,共转染至CHO-dhfr^-细胞中。经选择性培养基培养、细胞染色体DNA dot blot实验、Northern blot及Western blot实验鉴定,筛选出能表达rhIL-12的细胞株,经氨甲喋呤加压诱导,表达量约为150u/ml,且经液氮冻存3mo以上仍有表达。本实验还研究 相似文献
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以LipofectinTM介导将pRc/CMVNPY质粒转染入CHO细胞,经G418筛选及Northernblot、ELISA和HPLC检测,得到稳定表达神经肽Y(NeuropeptideY,NPY)的细胞株,表达量为2~10ng/(ml·107细胞);表达时相分析结果显示转染细胞在转染后第4天表达量最高。 相似文献
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目的:分别构建两个高效表达人突变CD59的CHO细胞真核表达系统,探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础。方法:将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列(HM7、HM8)的重组pALTER质粒运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞,用含有400μg/ml新霉素类似物(G418)的F12培养基筛选出阳性表达克隆,应用荧光免疫组化(FIH)检测CD59在CHO细胞表面的表达。经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性。结果:运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO,成功筛选出的阳性克隆经FIH证明突变CD59可在CHO细胞表达。染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性,且在高糖环境下易糖基化,糖基化后抗补体活性明显降低。结论:建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统,获得阳性克隆细胞株。初步研究证实突变CD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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利用基因工程技术构建表达人C1抑制物(C1-INH)的表达质粒pSVC,该质粒与编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的表达质粒pSV2-dhfr一起共转染CHO-dhfr~细胞,获得了人C1-INH在真核细胞中的高效表达,表达产物经SDS-PAGE、免疫沉淀及免疫印迹分析,表现为一条分子量在106×10~3处的明显反应条带。此外,在94×10~3处尚有一条稍弱的条带,可能为C1-INH的降解形式或搪基化不完全形式。功能活性分析采用酯酶裂解抑制法间接测定。此外,还对共转染时,目的基因质粒与标志基因质粒之间的比例进行了比较性探讨。 相似文献
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人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 克隆人IL-18结合蛋白A(hIL-18BPa)的cDNA,构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT-PCR,自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中,经测序确证后,将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1中。以脂质体介导法,将其转染CHO细胞,用G418筛选抗性克隆,ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3.1后,成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后,获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后,证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因,并实现了在CHO细胞中的稳定表达,为研究其生物学活性奠定了基础。 相似文献
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人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达 总被引:1,自引:2,他引:1
目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。 相似文献
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目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检测。结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株。膜蛋白经WesternBlot检测具有生物活性。结论GPIB71在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础。 相似文献
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目的克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞.经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。 相似文献
10.
将人IL-2Ra cDNA导入CHOdhfr~-细胞,经ELISA对180个重组克隆的鉴定,筛选出13株高产克隆,其OD值均大于0.80。再经MTX扩增基因试验,获得了3株更高表达水平的克隆,其OD值分别为1.95、1.86及1.66。稳定性试验表明:MTX诱导前的高效表达水平在30代次时未见改变,MTX的扩增基因效果可维持15—20代次,rIL-2Ra的分子量为50—55kd,具有Tac抗原性和结合IL-2的能力。Southern分析证实:MTX是通过扩增外源基因的份额来提高重组产物的表达水平。本试验为发酵培养重组CHO细胞、大量制备IL-2Ra蛋白奠定了坚实基础。 相似文献
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人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。 相似文献
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目的:在仓鼠卵巢细胞CHO细胞中高效表达糖基磷脂酰肌醇GPI-B7-1(B7-1即CD80)融合蛋白,获得大量融合蛋白以研究GPI-B7-1在肿瘤治疗中的应用潜力。方法: 构建真核表达载体pc3.1/GPI-B7-1,利用脂质体lipofectamine 2000将其转染CHO细胞,G418加压筛选抗性克隆,流式细胞仪检测细胞膜上GPI-B7-1融合蛋白的表达情况,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定其免疫活性。结果: 真核表达载体转染CHO细胞经G418筛选后,流式细胞分析证实为GPI锚定蛋白,SDS-PAGE在60 kD左右蛋白表达量明显高于对照组,在Western blot 在60 kD左右有一条强的棕色条带,说明GPI-B7-1在CHO中得到表达。结论: 在CHO细胞中高效表达GPI-B7-1融合蛋白,可获得大量融合蛋白,对进一步研究GPI-B7-1在肿瘤治疗中的应用打下基础。 相似文献
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小鼠IL-12单链融合基因真核表达质粒构建及其肿瘤基因治疗初探 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 构建小鼠IL 12单链融合基因 (msIL 12 ) ,进行基因治疗初探。方法 用RT PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞总RNA分别获取p4 0cDNA和p35cDNA ,2次PCR引入linker后 ,依次克隆入pcDNA3质粒 ,构建成msIL 12真核表达质粒 (pmsIL 12 ) ;用DEAE dextran法将PEG纯化的pmsIL 12转染COS 7细胞 ,用ELISA法检测其培养上清 (转染上清 )IL 12蛋白含量。皮内注射PEG纯化的pmsIL 12 ,用MTT法检测其对正常小鼠脾细胞NK活性的影响 ,观察其对荷H2 2腹水型肝癌细胞瘤小鼠生存期的影响。结果 所得p35cDNA序列与GenBank登录号M86 6 72完全一致 ;所得IL 12p4 0cDNA序列与GenBank登录号AH0 0 4 85 9报道完全相同 ,除第 10 0 0位碱基是G而不是A(但所编码氨基酸相同 ,都是丝氨酸 )外也与GenBank登录号M86 6 71报道相同。成功构建了小鼠IL 12单链融合基因真核表达质粒pmsIL 12 ,其转染COS 7细胞后的转染上清IL 12蛋白含量达 (2 .5 5± 0 .6 0 )ng ml。皮内注射pmsIL 12后 ,使正常小鼠脾细胞NK活性显著增强 (P <0 .0 1) ,使荷H2 2肝癌细胞瘤小鼠的生存期明显延长(P <0 .0 5 )。结论 构建了小鼠IL 12单链融合基因的真核表达质粒 ,可用于基因治疗研究。 相似文献
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小鼠psIL-12质粒抗结核分枝杆菌感染的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的观察、评价小鼠白细胞介素12真核表达质粒psIL-12对结核分枝杆菌感染小鼠细胞因子水平的影响及疗效.方法结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠随机分成生理盐水、pcDNA3.1对照组,psIL-12治疗组,每组各6只.感染4周后分别予以生理盐水、pcDNA3.1、psIL-12,第1次治疗后8周处死检测器官活菌数,脏器重量指数(WI),脾淋巴细胞特异性IFN-γ、IL-4细胞因子分泌水平,并观察肺、脾组织病理改变情况.结果 psIL-12治疗组肺组织活菌数(每mg log10CFU/ml)为7.41±0.50,与对照组(8.15±0.37、8.19±0.29)比较显著降低(P<0.05);脾组织荷菌量(每mg log10 CFU/ml)为5.31±0.21,与对照组(5.76±016、5.88±0.21)比较显著降低(P<0.05).psIL-12治疗组脾脏重量指数为0.58±0.05,与对照组(1.02±0.08、1.10±0.02)比较显著降低(P<0.05).脾淋巴细胞IFN-γ(pg/ml)为478.0±10.1,与对照组(134.5±15.7、125.1±8.2)比较显著升高(P<0.05).各组间IL-4水平差异无显著性.对照组肺组织病理改变以变质、渗出为主,而psIL-12治疗组以增生改变为主.对照组与治疗组间比较脾脏病理改变不明显.结论 psIL-12真核表达质粒对小鼠结核分枝杆菌感染有一定的治疗作用,可能通过诱导促进IFN-γ产生,调节TH1/TH2应答类型,起到抗结核分枝杆菌感染的作用. 相似文献
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目的 构建人源抗-HAVFab真核表达载体并进行表达。方法 采用DNA重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体pCdhfrl、pCDNA3.1;以脂质体介导法转染CHO细胞,经G418筛选细胞,ELISab基因的表达。结果 成功地构建了Fab表达载体。转染细胞后,经ELISA检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Fab片段。结论Fab真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 相似文献
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目的 构建野生型和突变型PSD-95(postsynaptic density protein 95)的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞系中表达.方法 采用RT-PCR扩增大鼠PSD-95的cDNA,以PSD-95-GW1为模板,以PCR扩增PSD-95序列的突变体Myc-ΔSG(-SH3-GK)和Myc-ΔG(-GK),分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ).以脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞,免疫印迹法鉴定PSD-95及其突变体的蛋白表达.结果 限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型/突变型PSD-95基因完全正确;免疫印迹法检测表明,转染的重组质粒能在COS-7细胞中高效表达.结论 构建的PSD-95-pcDNA3.1( )、Myc-ΔSG-pcDNA3.1( )和Myc-ΔG-pcDNA3.1( )重组载体在COS-7细胞系中高效地表达,为深入研究PSD-95在缺血性脑损伤中的作用及机制打下基础. 相似文献
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抗rh-bFGF嵌合抗体真核表达载体的构建与表达 总被引:5,自引:2,他引:3
目的 :构建并在真核细胞中表达抗人重组碱性成纤维生长因子 (rh bFGF)人 鼠嵌合抗体。方法 :从分泌抗rh bFGF鼠单抗(mAb) 1F11的杂交瘤细胞中扩增、克隆VL、VH 基因 ,从质粒pMDHC和pMDLC中扩增、克隆CL、CH 基因 ,测序鉴定后插入真核表达载体 ,并转化二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO dhfr- )细胞进行表达。采用间接ELISA检测表达产物的人源性和其抗原结合活性。结果 :序列测定表明所克隆的抗体基因是功能性抗体的V区基因 ,在转化细胞的培养上清中可检测到抗rh bFGF嵌合抗体的表达。ELISA试验证实 ,该嵌合抗体具有人源C区 ,并具有鼠mAb 1F11的抗原结合活性。结论 :在真核细胞中成功地表达抗rh bFGF的人 鼠嵌合抗体 ,为其临床应用研究奠定了基础 相似文献