逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的：探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7（recombinant human bone morphogenetic protein7,rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法：体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞，构建rhBMP7逆转录病毒载体，利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，经G418筛选后，制备含目的基因和重组逆转录病毒液，病毒液感染骨骼肌卫星细胞，使用RT－PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果：成功地构建了逆转录病毒真核表达载体，逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7的mRNA。结论：采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中，目的基因可在mRNA水平有效表达。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）后的表达及表达产物对BM-SCs增殖的影响，用脂质体介导法将rhBMP-7基因转染BMSCs，用逆转录PCR技术和免疫组化SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达；再用^3H-TdR掺入法检测基因表达产物对正常培养的BMSCs增殖的影响。结果表明：转基因细胞能高效表达外源基因，且表达时间长达4周；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖。该结果为基因增强的组织工程技术用于关节软骨缺损的修复提供了理论依据。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

重组骨形态发生蛋白—7基因转染软骨细胞的实验研究

目的：研究外源性人重组骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因在转染的软骨细胞中的表达情况。方法：用脂质体介导法将rhBMP-7转入兔关节软骨细胞,分别用免疫组化染色和逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）检测其表达,同时用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT法）检测了表达产物的活性。结果：48h后转染的软骨细胞有明显的pcDNA3-rhBMP7基因表达,转染细胞的表达产物对正常软骨细胞的增殖有显著的促进作用。结论：外源性rhBMP-7基因可在软骨细胞中获得高效表达,这为关节疾病的基因治疗提供了理论基础。     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞后细胞形态及生物学变化

目的 通过基因转染方法，用骨形态发生蛋白3（BMP3）基因转染成纤维细胞（NIH－3T3细胞），观察转染不同时期被转染细胞的形态学改变及细胞内碱性磷酸酶含量的变化，初步探讨骨组织工程种子细胞来源的另一途径。方法 定向克地将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，观察不同时期被转染细胞的形态学变化，钙钴法染色转染细胞时相的碱性磷酸酶并作图像分析。结果 转染细胞培养筛选6周提取的总RNA用Dot blot可以检出有明显的BMP3 mRNA表达。转染细胞第1周细胞形态由长梭形变为杆状，转染后2周细胞由长梭形变为多角形，转染后4周细胞变为多边形，类似成骨细胞，钙钴法碱性磷酸酶染色示转染组细胞胞浆内有大量染色黑色的碱性磷酸酶颗粒，及图像分析及转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。结论 通过向NIH－3T3细胞内转染BMP3基因，可以使NIH－3T3细胞形态向成骨细胞形态发生转化，被转染细胞内碱性碱性磷酸酶水平明显增高，已具有成骨细胞某些特性。     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１６ｂ中，在大肠杆菌中成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导导位体骨的趋势。     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

壳聚糖作为缓释重组人骨形态发生蛋白-2载体的实验研究

目的:将壳聚糖作为重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)的载体,通过体外释放实验观测rhBMP2在壳聚糖中释放的动力学过程,探讨壳聚糖对rhBMP2的缓释作用。方法:采用乳液冷冻干燥法制作rhBMP2/壳聚糖支架,单纯壳聚糖支架为对照组。对材料进行扫描电镜观察;将支架材料在磷酸盐缓冲液(PBS)中持续浸泡,通过高效液相色谱分析仪检测不同时间点浸出液中rhBMP2的含量,进行累积释放量的动态观察,绘制rhBMP2释放曲线。结果:支架材料的形态学观察呈疏松多孔海绵状;rhBMP2从支架材料中释放的动力学过程第1天表现为“爆发性”释放(33.2%);第27天rhBMP2出现快速释放;第814天释放速度减慢;第1530天出现缓慢而持久的释放,至1个月释放量达81.3%。结论:多孔壳聚糖支架对rhBMP2有缓慢而持久的体外释放作用,可作为rhBMP2的缓释载体,为rhBMP2持续发挥骨诱导作用提供初步的实验基础。     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

骨形态发生蛋白激活自身肌肉间质细胞拯救骨髓衰竭

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)激活自身肌肉间质细胞以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法采用5-氟脲嘧啶与白消安合用诱导大鼠致死性再生障碍性贫血模型,于诱导再障前3d肌肉内植入重组人-BMP-2(rh-BMP-2),并以肌肉内植入琼脂为对照。观察血象、病理形态等变化以及两组再障大鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-2,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,随后形成骨及骨髓,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障大鼠,不仅血象与对照相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有56.3%大鼠存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照大鼠除1只存活超过3个月外(占4.3%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论BMP肌肉内植入可拯救骨髓造血衰竭,其机制可能与BMP诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关;本研究结果为应用成体自身干细胞进行细胞治疗提供了新的途径。     

骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的研究骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响。方法将壳聚糖与海藻酸钠制成复合微球,包裹或不包裹骨形态发生蛋白。采用体外细胞培养技术,将两种微球分别与细胞一起培养,通过对细胞增殖率及碱性磷酸酶活性、考马斯亮蓝的检测,观察两种微球对培养细胞的影响。结果两种微球对骨髓基质细胞的增殖均无明显影响,但骨形态发生蛋白微球对细胞的分化及分泌功能有明显的促进作用。结论骨形态发生蛋白能够提高骨髓基质细胞的体外成骨能力,且壳聚糖海藻酸钠微球可作为骨形态发生蛋白的良好载体。     

Construction of Adeno-associated Virus System for Human Bone Morphogenetic Protein 7 Gene

To construct the recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector with human bone morphogenetic protein 7 （BMP7） and observe the BMP7 mRNA expression in vitro, BMP7 CDS sequence was cloned into expression plasmid pAAV-MCS of AAV Helper Free System. The recombinant plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid, pAAV-RC, pHelper were co-transfected into AAV-293 cells according to the calcium phosphate-based protocol. The viral stock was collected by 4 rounds of freeze/thaw. After purified and concentrated, the recombinant virus titer was determined by dot-blot assay. HEK293 cells were transfected with the recombinant virus at different MOI, and the expression of BMP7 mRNA was detected by RT-PCR. The results showed rAAV-BMP7 was constructed and packaged successfully. The physical particle titer was 2.5×10^11 vector genomes/mL. There was different expression level of BMP7 mRNA after transfecton. These data suggested that recombinant AAV mediated a stable expression of hBMP7 mRNA in 293 cells. The AAV production method may pave the way of an effective strategy for the jaw bone defection around dental implants.     

人重组骨形成蛋白-7对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的:研究人重组骨形成蛋白-7（ rhBMP-7）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)增殖、分化能力的影响,为进一步探讨其促进牙周组织再生奠定细胞学基础。方法：选取因阻生或正畸需要拔除的牙齿,无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织,采用组织块法培养牙周膜成纤维细胞,经免疫细胞化学鉴定后接种培养板,加入含浓度为50、100、200及400 μ mol·L^-1 rhBMP-7的培养液。分别于培养后1、3及5 d,采用MTT法测定HPDLCs的增殖能力,采用ELISA检测HPDLCs培养液中ALP的活性。结果:原代牙周膜细胞生长缓慢,加入rhBMP-7后细胞生长旺盛,细胞形态为纺锤形或成纤维样,胞浆透明,生长状态良好。随着时间的延长,rhBMP-7在100、200及400 μ mol·L^-1 各浓度时,HPDLCs细胞的增殖率呈逐渐增加的趋势(P<0.01),但各浓度组间比较差异无显著性(P>0.05);
与对照组比较,100、 200及400 μ mol·L^-1 rhBMP-7 各浓度组HPDLCs细胞裂解液和培养液中的ALP活性均增高(P<0.05或P<0.01),其中200 μ mol·L^-1 rhBMP-7 组ALP活性最高。结论: BMP-7可能通过促进HPDLCs细胞的增殖和向骨细胞分化功能而参与牙周组织改建。     

负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验

目的 探讨以聚乳乙醇酸(poly-(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨髓基质干细胞(BM-SCs)构建成新型组织工程骨并观察其在动物体内的成骨能力。方法 制作新西兰大白兔右桡骨中段15mm骨缺损实验模型,随机分为实验组、对照组和空白组,实验组植入同时负载5mgBMP及1×10⁶个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PLGA、对照组植入负载1×10⁶个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PLGA、空白组仅植入PLGA。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况、比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4、8、12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察,图像分析骨小梁的生成数量。结果 实验组在12周内骨缺损完全修复,且同时期内新生骨的数量和质量显著优于对照组,空白材料组骨缺损主要由纤维结缔组织填充。结论 利用含BMP的PLGA支架与BMSCs复合构建的新型组织工程骨具有良好的骨缺损修复能力。     

Transfection of Articular Chondrocytes with rhBMP7 Gene and Its Expression

The repair of osteochondral defects remainsone of the most intensely studied orthopaedic top-ics.Nowadays the focus is on gene modified tissueengineering[1] .It is suggested that articular chon-drocytes could serve as satisfactory target cells,while bone morphogenetic protein- 7(BMP- 7) couldstimulate new bone and cartilage tissue forma-tion[2 ] .In the present study,a recombinant plas-mid pc DNA3 - rh BMP7was transduced to culturedrabbit articular chondrocytes in vitro in order toexplore …     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.