CD40培养体系的建立及B淋巴细胞的体外培养

采用自行研制成的功能性人ＣＤ４０单克隆抗体，转导ＣＤ３２的Ｌ细胞和细胞因子建立体外研究人Ｂ淋巴细胞增殖，生长和分化的ＣＤ４０系统。方法（１）流式细胞仪分析ＣＤ４０分子的表达；（２）在ＣＤ４０激发型单抗与ＬＣＤ３２共培养中，加入ＩＬ－４及其它细胞     

新生儿B细胞CD40表达与CD40单抗诱导的B细胞功能

采用流式细胞术检测新生儿Ｂ细胞（ＢＬ）ＣＤ４０表达的同时以ＣＤ４０单抗取代Ｔ辅助细胞（ＴＨ）ＣＤ４０配体（ＣＤ４０Ｌ）作用，观察其诱导的体外ＢＬ增殖及免疫球蛋白（Ｉｇ）产生能力。结果发现新生儿ＢＬＣＤ４０表达水平与成人接近，ＣＤ４０单抗可使新生儿低下的ＢＬ增殖，Ｉｇ产生及类别转换能力明显增高。本文提示新生儿ＢＬ功能低下并非ＢＬ内在缺陷所致，ＴＨ表达的ＣＤ４０Ｌ或细胞因子（ＣＫ）不足可能在其中起重要作用。     

两种状态抗CD3单抗诱导人T淋巴细胞活化增殖的初步观察

目的：观察并比较粘附状态抗ＣＤ３单抗和游离状态抗ＣＤ３单抗诱导人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）活化增殖的能力。方法：采用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入淋巴细胞增殖试验、苔盼蓝拒染法、间接免疫荧光染色法以及ＣＴＬＬ细胞ＩＬ－２检测法，分别检测人外周血单个核细胞，经两种状态抗ＣＤ３单抗刺激后，其增殖活性、外源性ＩＬ－２的协同作用、内源性ＩＬ－２释放以及ＩＬ－２Ｒ表达等生物免疫学指标。结果：粘膜状态抗ＣＤ３单抗刺激     

IVIG抑制脐血细胞免疫球蛋白的机制

为阐明静脉免疫球蛋白（ＩＶＩＧ）抑制新生儿Ｂ细胞免疫球蛋白释放的机制，采用间接免疫荣光标记法及ＲＴ－ＰＣＲ法分别检测了ＩＶＩＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）作用后的脐血淋巴细胞ＣＤ４０与ＣＤ４０配体表达及其分泌的ＩＬ－２．ＩＬ－４ｍＲＮＡ表达。结果：１．ＩＶＩＧ不改变脐血单个核细胞（ＣＢＭＣ）中ＣＤ４０＾＋染色阳性细胞的百分比：ＩＶＩＧ促进了ＣＢＭＣ的ＣＤ４０Ｌ表达２．ＩＶＩＧ抑制ＣＢＭＣ ＩＬ－２．ＩＬ－４     

α—CD3单克隆抗体对肿瘤特异性T细胞的扩增和杀瘤活性的影响

为寻找更有效的肿瘤过继性免疫治疗的方案，用α－ＣＤ３单克隆抗体（单抗）激活ＦＢＬ－３红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞获取肿瘤特异性Ｔ细胞，并观察α－ＣＤ３单抗对肿瘤特异性Ｔ细胞的增殖、杀瘤活性及表型影响，体外实验结果显示，免疫小鼠脾细胞经α－ＣＤ３单抗激活后，采用低剂量ＩＬ－２即可维持其长期高度的、持续的增殖；又培养过程中α－ＣＤ３单抗持续存在可大大促进其对肿瘤的特异性杀伤。细胞分型分析结果也支持     

抗CD40单克隆抗体诱导树突状细胞增殖和分化成熟作用研究

探讨ＣＤ４０分子在树突状细胞和外周血单核细胞表达的意义。方法将人外周血单核细胞经不同组合的细胞因子共培养共获得了树突状细胞，经流式细胞仪表型分析，活细胞计数，混合淋巴细胞反应等方法测定抗人ＣＤ４０单抗体ＣＤ４０分子的激发作用。结论抗人ＣＤ４０激发型单抗是一种潜在的免疫激动剂。     

两种状态抗CD_3单抗诱导人T淋巴细胞活化增殖的初步观察

目的：观察并比较粘附状态抗ＣＤ３单抗和游离状态抗ＣＤ３单抗诱导人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）活化增殖的能力。方法：采用３Ｈ－ＴｄＲ掺入淋巴细胞增殖试验、苔盼蓝拒染法、间接免疫荧光染色法以及ＣＴＬＬ细胞ＩＬ－２检测法，分别检测人外周血单个核细胞，经两种状态抗ＣＤ３单抗刺激后，其增殖活性、外源性ＩＬ－２的协同作用、内源性ＩＬ－２释放以及ＩＬ－２Ｒ表达等生物免疫学指标。结果：粘附状态抗ＣＤ３单抗刺激ＨＰＢＭＣ，其增殖活性、活细胞总数以及增殖活性维持的时间均高于游离状态抗ＣＤ３单抗，且前者不依赖外源性ＩＬ－２；粘附状态抗ＣＤ３单抗诱导ＨＰＢＭＣ释放内源性ＩＬ－２以及细胞表面ＩＬ－２Ｒ表达的能力也强于游离状态抗ＣＤ３单抗。结论：粘附状态抗ＣＤ３单抗比游离状态抗ＣＤ３单抗具有更强的诱导人Ｔ淋巴细胞活化增殖能力。     

膀胱癌可溶性抗原诱导细胞毒T细胞的实验研究

目的 观察膀胱癌可溶性抗原诱导细胞毒Ｔ细胞生长,为构建膀胱癌疫苗及过继性免疫治疗提供实验基础。方法 提膀胱癌可溶性抗原（ＴＳＡ）,用ＴＳＡ、抗ＣＤ－３单抗、ＩＬ－２联合诱导外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）,动态观察细胞增殖,进行细胞表型分析和细胞因子测定;并与ＩＬ－２诱导的ＬＡＫ细胞,抗ＣＤ－３单抗、ＩＬ－２诱导的ＣＤ３－ＡＫ细胞进行比较。结果 实验组细胞第８ｄ增殖７．５２倍,第１２ｄ增殖２８．９２倍     

协同刺激信号α—CD28单抗增强肿瘤特异性CTL体内外的杀瘤活性

目的 采用α－ＣＤ２８单抗增强α－ＣＤ３单抗刺激的肿瘤特异性Ｔ细胞的杀瘤活性。方法 采用２种方案培养ＦＢＬ－３免疫的小鼠脾细胞。（１）使用α－ＣＤ３单抗４８ｈ后,加入α－ＣＤ２８单抗同时使用４８ｈ后,加入α－ＣＤ３单抗、α－ＣＤ２８单抗和２０Ｕ／ｍｌ ｒＩＬ－２（α－ＣＤ３＋α－ＣＤ２８＋ＩＬ－２组）。＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测两组效应细胞的增殖水平。标准４ｈ－＾５１Ｃｒ释放法检测两组效应细胞的杀伤     

抗CD3McAb诱导外周血单个核细胞活化增殖的观察

目的：观察抗ＣＤ３ＭｃＡｂ诱导人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）活化增殖过程中的影响因素及抗ＣＤ３ＭｃＡｂ激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）免疫学特性的变化。方法：采用ＭＴＴ法和苔盼蓝染色法，ＩＬ－２依赖细胞株（ＣＴＬＬ细胞）增殖实验、ＴＮＦ－α（双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法）试剂盒以及间接免疫荧光法检测ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖活性，ＩＬ－２，ＴＮＦ－α的产生及ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ－２Ｒ等的表达。结果：     

激发型抗CD40单抗介导恶性肿瘤细胞凋亡及其机制探讨

目的 探讨激发型CD40单克隆抗体对人B淋巴细胞恶性肿瘤的生物学效应及其机制。方法 将激发型CD40单克隆抗体5C11加入肿瘤细胞的体外培养体系，采用细胞计数，流式细胞仪等方法分析单克隆抗体5C11对不同肿瘤细胞株的作用。结果 5C11能引起CD40表达的多发性骨髓瘤（MM）细胞株XG2和恶性淋巴瘤细胞株Daudi发生同型聚集，抑制其生长并介导凋亡；CD40分子介导的XG2和Daudi细胞凋亡作用与可溶性TNF产生无关。结论 激发型CD40单克隆抗体通过诱导B细胞恶性肿瘤细胞的凋亡。抑制肿瘤细胞的体外生长。     

CD40及CTLA4模拟小分子肽诱导免疫耐受的实验研究

目的 最新实验数据显示了CD28－B7和CD40－CD154共刺激信号通路在T细胞活化与效应过程中起重要作用。治疗策略关键在于干扰这些通路，诱导移植物宿主产生免疫耐受。方法 我们运用生物信息学和多肽合成技术模拟CTLA4和CD40小分子肽，以阻断这些信号通路。通过MLC，IL－2测定及同源小鼠皮肤皮肤移植实验，检测了不同剂量的两种小分子短肽在体内和体外对免疫反应的影响。结果 所有治疗组的巴细胞增殖降低，IL－2表达低下。在不同水平与时间段，皮肤移植物存活时间显著延长。结论 成功模拟CTLA4和CD40小分子肽，该小分子肽能有效地阻断调节T细胞活化的CD28－B7和CD40－CD154分子连接，是潜在的具有临床应用价值的免疫抑制剂。     

IL-36γ促进人CD8+T淋巴细胞细胞因子的分泌

目的: 探讨白细胞介素36γ（IL-36γ）是否能够增强体外培养的人CD8⁺T淋巴细胞分泌γ干扰素。方法: 经密度梯度离心法从健康人外周血分离获得外周血单个核细胞（PBMC）,经磁珠阳性选择富集纯化CD8⁺T淋巴细胞,分别用CD3单克隆抗体（mAb）+CD28 mAb,CD3 mAb+CD28 mAb+IL-12,CD3 mAb+CD28 mAb+IL-36γ以及CD3 mAb+CD28 mAb+IL-12+IL-36γ 4种因子组合刺激培养24 h和72 h。收集细胞,采用免疫荧光标记和流式细胞术分析分选富集的CD8⁺T淋巴细胞纯度以及γ干扰素的表达;采用实时PCR检测各组细胞IL-36受体（IL-36R）、γ干扰素和颗粒酶B mRNA的表达。结果： 人CD8⁺T淋巴细胞表达IL-36R;各组因子刺激的人CD8⁺T淋巴细胞形态没有明显差异;人CD8+T淋巴细胞经IL-36γ刺激后,γ干扰素、颗粒酶B mRNA表达上调;同时, IL-36γ和IL-12 具有协同刺激CD8⁺T淋巴细胞的作用。结论： IL-36γ能促进体外培养的人CD8⁺T淋巴细胞分泌细胞因子,并且与IL-12具有协同作用。     

人B淋巴母细胞系体外培养方法的优化及其影响因素

目的探讨体外建立健康人外周血B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的优化方法及其影响因素。方法用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞（PBMC）,加入CD40激发型抗体（5C11）、CpGDNA免疫调节基因序列以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A（CysA）抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察B-LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析B-LCLs膜表面分子CD19的表达水平。结果PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B-LCLs。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。CD40激发型抗体（5C11）及CpG免疫调节基因序列联合EBV感染人PBMC,明显地提高了转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。结论CD40信号激发和CpG免疫调节基因序列联合运用能有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系。     

PD-L1~+ HeLa细胞对人外周血活化T细胞的免疫调节作用

目的探讨人宫颈癌细胞表达PD-L1对人外周血T细胞的免疫调节作用。方法采用PD-L1质粒转染人宫颈癌HeLa细胞株,将PD-L1+HeLa细胞与PHA刺激活化的人外周血T淋巴细胞混合培养,MTT法检测T细胞的增殖水平,流式细胞术分析T细胞凋亡率和CD8+/CD4+T细胞比例;ELISA检测PD-L1+HeLa细胞与PHA刺激活化的人外周血T淋巴细胞混合培养上清液IFN-γ的含量。结果 MTT检测显示与PD-L1+HeLa混合培养组的T细胞增殖光密度值为(0.31±0.02),明显低于与PD-L1-HeLa混合培养组的T细胞和对照组T细胞,分别为[(0.62±0.02)和(0.59±0.03),P<0.01];T细胞凋亡率明显高于与PD-L1-HeLa混合培养组和对照组T细胞,分别为(32.7%、17.9%和18.3%);CD8+/CD4+T细胞比值稍低于PD-L1-HeLa混合培养组和对照组T细胞(分别为0.86、0.91和0.89);与PD-L1+HeLa混合的T细胞培养上清液IFN-γ的含量低于与PD-L1-HeLa混合培养组和对照组T细胞,分别为[(801.1±20.5)pg/ml、(1 006.2±30.2)pg/ml和(1 070.2±113.3)pg/ml,P<0.01]。结论 PD-L1明显抑制人外周血活化T细胞增殖促进其凋亡并下调其免疫功能。     

病原体抗原刺激的正常人外周血CD4^＋T细胞对γδT细胞的影响

CD4 T辅助（Th）细胞和γδT细胞在抗微生物感染中发挥着重要作用，两者相互作用有待阐明。本文报道以胞内感染体结核杆菌、人类VI型疱疹病毒及胞外寄生虫阴道毛滴虫刺激活化从正常人外周血经洗淘法分离纯化的CD4 T细胞，结果各组活化的细胞均表现明显增殖和产生以白介素-2（IL－2）、γ干扰素（IFN－γ）显著升高为主的Th1型细胞因子分泌谱。利用细胞隔离渗透性共培养体系，将抗原活化的CD4 T细胞和γδT细胞共培养，结果显示γδT细胞的增殖和细胞毒作用均可为CD4 T细胞产生的可溶性因子所显著增强。这提示在抗感染免疫中，CD4 Th1细胞可通过Th1型细胞因子促进γδT细胞功能。     

CD40配体刺激人外周血来源B细胞的长期培养及增殖活化

目的 建立外周血来源B细胞体外长期培养体系,观察培养过程中B细胞的增殖活化及抗原提呈功能.方法 利用重组人可溶性CD40配体(sCD40L)刺激人外周血B细胞的长期培养过程中,流式细胞技术检测B细胞DNA周期及B细胞表面CD80、CD86、主要组织相容复合物(MHC)Ⅰ类及Ⅱ分子的表达状况;观察B细胞增殖情况及B细胞活化后表面分子的表达.采用乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)-异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗原多肽与B细胞共孵育,检测B细胞对抗原多肽的负载能力.结果 人外周血B细胞在sCD40L培养体系中可长期培养达50 d,在此期间,B细胞绝对计数增加近10倍,外周血B细胞比例由8.21%增高到70.67%,活化的B细胞高表达CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ,并可负载HBV核心抗原肽.结论 sCD40L培养体系可在体外长期培养人外周血B细胞,并使B细胞增殖活化,具有抗原提呈细胞的特征.     

间充质干细胞的培养特性及其相关细胞因子表达

目的:探讨体外培养间充质干细胞的方法及其生物学特性,并检测与其抑制T淋巴细胞增殖活性减轻GVHD机制的细胞因子的表达。方法:通过密度梯度离心及贴壁筛选法分离、纯化及培养间充质干细胞,观察其生物学特性,并进行免疫细胞化学染色观察间充质干细胞是否表达TGF-β1、HGF。结果:采用贴壁筛选法培养间充质干细胞原代经7天贴壁后变为梭形,经14~17天可长满瓶底,传代后3~4天即可长满,免疫分型示CD29+,CD44+,CD34-,CD45-,免疫细胞化学染色显示高度表达TGF-β1及HGF。结论:密度剃度离心结合贴壁筛选法培养间充质干细胞可获得纯度较高,生物学特性稳定的间充质干细胞;间充质干细胞可能通过TGF-β1与HGF两种细胞因子抑制T淋巴细胞增殖减轻移植后GVHD。     

OX40在溃疡性结肠炎中的表达及意义

目的：研究溃疡性结肠炎（UC）患者OX40分子的表达,以及CD4＋OX40＋T细胞的免疫表型和免疫学功能.方法：从活动性UC患者肠粘膜标本中分离和纯化粘膜固有层CD4＋T细胞（LP-CD4＋T）.用FACS多参数分析法测定OX40在不同的CD4＋T细胞上的表达.用ELISA BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）法测定LP-CD4＋T细胞的增生程度以及不同刺激剂对它们增生程度的影响.结果：UC病变部位LP-CD4＋T细胞表达OX40明显高于健康对照者外周血、UC患者外周血CD4＋T细胞以及UC患者非病变部位CD4＋T的表达.LP-CD4＋OX40＋T细胞表达淋巴细胞活化标记CD25、CD38、CD45RO和HLA-DR均明显高于LP-CD4＋OX40-T细胞的表达（P＜0.01）.抗OX40单抗可明显增强病变部位LP-CD4＋T细胞的增生反应.相反,抗OX40L单抗则能明显抑制病变部位LP-CD4＋T细胞的增生.结论：OX40在UC患者病变部位的LP-CD4＋T细胞上表达明显增加,LP-CD4＋OX40＋T细胞是一类在原位被特异性抗原激活后扩增的T细胞,它们在UC的免疫病理机制中起重要作用.抗OX40L能够抑制其增生反应,可能是一种有效治疗UC的新方法.