蟾毒灵通过下调PKM2抑制黑色素瘤细胞增殖、 迁移与侵袭的实验研究

目的：考察蟾毒灵（Bufalin）对黑色素瘤细胞增殖、迁移与侵袭,以及对有氧糖酵解关键酶M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）的调控作用。方法：分别使用MTT、划痕及Transwell实验,考察蟾毒灵对A375黑色素瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响;利用试剂盒检测蟾毒灵对A375细胞有氧糖酵解主要指标乳酸、葡萄糖及丙酮酸激酶的影响;蛋白免疫印迹实验探讨蟾毒灵对PKM2蛋白表达的影响,以及对下游肿瘤迁移与侵袭相关蛋白表达的影响。结果：蟾毒灵能显著抑制A375细胞的增殖、迁移与侵袭;还能抑制A375细胞的有氧糖酵解及PKM2的蛋白表达,进而下调肿瘤转移相关蛋白MMP-2、MMP-9、N-cadherin的表达。结论：蟾毒灵对A375黑色素瘤细胞的增殖、迁移与侵袭具有明显的抑制作用,其抑制机制可能与抑制肿瘤有氧糖酵解途径中关键酶PKM2有关。     

蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响

摘要目的：研究蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨其在膀胱癌中的抗肿瘤机制。方法：采用MTT法测定蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖的影响;流式细胞术（FCM）检测蟾毒灵对癌细胞凋亡和细胞周期的影响;RT—PCR法检测癌细胞周期蛋白D1（CyclinDl）基因表达情况。结果：蟾毒灵可抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,并呈现出时间和浓度依赖性;蟾毒灵能诱导T24细胞凋亡;20nmol／L浓度的蟾毒灵预处理膀胱癌T24细胞后,与对照组（36．42％）进行比较,可分别在12h（69．76%）和24h（88．14%）显著诱导细胞G0／G1期阻滞（P〈0．05）,且可降低膀胱癌T24细胞的CyclinDlmRNA表达水平。结论：蟾毒灵能显著抑制人膀胱癌T24细胞增殖,诱导T24细胞G0／G1周期阻滞,下调人膀胱癌T24细胞CyclinDl基因表达。     

蟾毒灵抗肝细胞癌作用及机制研究

肝细胞癌早期诊治困难,手术切除率低,放化疗疗效差,蟾毒灵是蟾酥中抗肿瘤作用最强蟾毒配基,蟾毒灵对人正常细胞没有作用,而对肝癌细胞具有明显的杀伤,抑制肝癌细胞生长。本文从蟾毒灵抗肝细胞癌生长作用及其相关作用机制进行论述,说明蟾毒灵在肝细胞癌治疗中重要意义和研究前景。     

蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的作用和诱导细胞调亡的研究

目的观察蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的疗效和诱导细胞凋亡作用。方法建立裸鼠人胰腺癌移植瘤模型,随机分为蟾毒灵低剂量组(1.0mg/kg)、蟾毒灵高剂量组(1.5mg/kg)、5-Fu组(24mg/kg)、5-Fu+低剂量蟾毒灵组(24mg/kg+1.0mg/kg),生理盐水(NS)组。腹腔注射给药,1次/d,连续给药6d。各组保留6只荷瘤鼠观察带瘤生存期,其余6只于用药第7天处死,测量鼠重变化、肿瘤生长抑制率;TUNEL法检测瘤体凋亡指数。结果治疗后,与NS相比,蟾毒灵高、低剂量组裸鼠体重无显著差异(P>0.05),5-Fu组、5-Fu+低剂量蟾毒灵组裸鼠体重明显降低差异(P<0.01);各用药组瘤体体积与NS组相比均显著缩小(P<0.05),蟾毒灵高剂量组较低剂量组瘤体体积显著缩小(P<0.05),蟾毒灵+5-Fu组较单纯蟾毒灵组瘤体体积显著缩小(P<0.05);蟾毒灵高、低剂量组平均生存期较NS组显著延长(P<0.05);蟾毒灵高剂量组凋亡指数明显高于其他各组(P<0.01)。结论蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌移植瘤有显著的抑制作用,诱导肿瘤细胞凋亡可能是蟾毒灵的抗肿瘤机理之一。     

蟾毒灵抑制人前列腺癌PC3细胞迁移侵袭的机制研究

本研究主要探讨了蟾毒灵(bufalin)对人前列腺癌PC3细胞的体外增殖、迁移和侵袭的抑制能力,初步探讨蟾毒灵抑制上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)过程的分子机制。采用MTT法评价PC3细胞活力;划痕和Transwell实验用于检测细胞的迁移和侵袭能力;采用Western blot实验检测EMT和整合素家族蛋白的表达情况。结果显示,蟾毒灵对人前列腺癌PC3细胞的半数抑制浓度值为0.26±0.03μmol·L-1,蟾毒灵处理后, PC3细胞的迁移速度变慢(P <0.05),穿过微孔滤膜的PC3细胞数量减少(P <0.05),这表明蟾毒灵能够浓度依赖性地抑制PC3细胞的增殖、迁移与侵袭能力。本研究发现蟾毒灵可以影响EMT相关蛋白的表达,包括E-钙黏附素(E-cadherin)的上调以及N-钙黏附素(N-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、基质金属蛋白酶2 (MMP2)、癌基因c-myc、锌指转录因子Snail的下调;蟾毒灵还可以抑制整合素家族蛋白的表达,包括...     

蟾皮中蟾毒配基类成分的分离与鉴定

目的研究中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizansCantor)皮中的蟾毒配基类成分。方法利用反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱、重结晶等手段分离纯化蟾皮中的蟾毒配基类成分,根据化合物的理化性质和各种波谱学数据鉴定其化学结构。结果分离得到11个蟾毒配基类化合物,分别鉴定为脂蟾毒配基(resibufogenin,1)、华蟾毒精(cinobufagin,2)、蟾毒灵(bufalin,3)、远华蟾毒精(telocinobufagin,4)、蟾毒它灵(bufotalin,5)、去乙酰华蟾毒它灵(desace-tylcinobufotalin,6)、嚏根草苷元(hellebrigenin,7)、沙蟾毒精(arenobufagin,8)、日蟾毒它灵(gam-abufotalin,9)、11β-羟基脂蟾毒配基(11β-hydroxylresibufogenin,10)、华蟾毒它灵(cinobufotalin,11)。结论化合物10和11为首次从中华大蟾蜍皮中分离得到。     

三种抗肿瘤中药有效成分对人脐静脉内皮细胞生长的影响

目的探讨蜂毒素、去甲斑蝥素、蟾毒灵3种抗肿瘤中药提取物的抗血管生成作用,并检测其量效关系,比较其抑制血管生成所需浓度与抑瘤浓度的关系。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定3种药物在不同浓度、时间对人肝癌细胞ECV304生长的抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50),观察量效、时效关系。结果 3种药物对ECV304细胞的生长有不同程度抑制作用(P<0.05或P<0.01),且呈浓度和时间的依赖性。蜂毒素在24、48和72h抑制ECV304细胞的IC50分别为7.64、4.25和2.64μg/ml,去甲斑蝥素为271.52、108.83和80.76μg/ml,蟾毒灵为1.104、0.355和0.0905μg/ml。结论蜂毒素、去甲斑蝥素、蟾毒灵有明确的抑制血管内皮细胞增殖、抗血管生成的作用。     

一测多评法测定心可宁胶囊中6种蟾蜍二烯内酯类化合物

目的 建立一测多评法同时测定心可宁胶囊中6种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量,并验证此方法在心可宁胶囊中应用的可行性和准确性。方法 以华蟾酥毒基为内参物,建立日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基与华蟾酥毒基的相对校正因子。分别采用外标法和一测多评法测定心可宁胶囊中6种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量,比较2种方法的结果差异,验证一测多评法的可行性和准确性。结果 日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基与华蟾酥毒基的相对校正因子分别为1.06,0.862,0.897,1.09,0.915;2种方法结果无显著差异。结论 以华蟾酥毒基为内参物建立的相对校正因子重现性好,一测多评法可用于心可宁胶囊中多个蟾蜍二烯内酯类成分的质量评价。     

蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡及其对TGF-β1表达的影响

目的研究蟾毒灵对裸鼠人胰腺癌的疗效及细胞凋亡的作用和机理。方法建立裸鼠人胰腺癌模型,随机分为对照组(NS)、5-氟尿嘧啶组(5-Fu)、蟾毒灵低剂量组(BuL)、蟾毒灵高剂量组(BuH)。分别腹腔注射生理盐水NS,20ml/kg、5-Fu24mg/kg、Bu1mg/kg、Bu1·5mg/kg。用药后第7天处死,计算肿瘤生长抑制率;TUNEL法检测瘤体凋亡指数;免疫组化S-P法检测P38、TGF-β1的表达。结果治疗后与NS组相比,各组瘤体体积均显著缩小(P<0·05)。其中Bu高剂量组瘤体体积明显相似文献   

静脉注射蟾毒它灵和华蟾毒它灵后大鼠胆汁中代谢产物的UPLC-UV-MS法分析

建立了超高效液相色谱-紫外分光光度-质谱(UPLC-UV-MS)法研究蟾毒它灵和华蟾毒它灵静脉给药后大鼠胆汁中的代谢产物.UPLC的高分辨率能够基线分离胆汁中的原药和代谢物,UV光谱图揭示了各种化合物量的关系,MS进一步对代谢物进行结构表征.结果显示,大鼠胆汁中原药的含量小于5%,主要代谢物是去乙酰基并羟基化蟾毒它灵和去乙酰基华蟾毒它灵.表明蟾毒它灵在大鼠体内代谢途径主要是水解并羟基化,华蟾毒它灵主要是水解反应.     

蟾酥的镇痛活性成分

药效学实验结果表明：蟾酥镇痛的活性成分主要存在于氯仿提取物中．分离蟾酥的氯仿提取物得到了脂蟾毒配基等６种单体化合物．６种单体化合物均具有一定的镇痛作用．华蟾毒精和脂蟾毒配基有非常显著的镇痛作用；蟾毒灵镇痛作用较平稳；南美蟾毒精镇痛作用较弱     

蟾酥中强心甾类化学成分的分离与鉴定

目的对蟾酥的氯仿提取物进行化学成分的分离与鉴定。方法以3倍量氯仿索氏提取,采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等手段对氯仿提取物进行分离纯化,根据其理化性质和波谱数据(1H-NMR、13C-NMR)进行结构鉴定。结果从蟾酥的氯仿提取物中分离得到6个强心甾类化合物,经光谱数据分析,鉴定其结构分别为脂蟾毒配基(resibufagenin,1)、华蟾毒精(cinobufagin,2)、蟾毒灵(bufalin,3)、华蟾毒它灵(cinobufatalin,4)、12 β-羟基华蟾毒精(12 β-hydroxylcinobufagin,5)、1β-羟基华蟾毒精(1β-hydroxylcinobufagin,6)。结论化合物6为一新的天然产物。     

蟾酥中蟾毒配基类化合物的抗肿瘤研究进展

蟾酥为我国名贵中药,研究发现,其所含的蟾毒配基类化合物对白血病、结肠癌、肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤,有明显抗肿瘤作用,且毒副作用较小。目前,蟾毒配基类化合物在肿瘤治疗中有较好的发展前景。笔者对其治疗肿瘤的机理进行综述。     

HPLC法测定蟾皮中蟾毒配基类成分的含量

目的用HPLC法测定蟾皮中蟾蜍灵、脂蟾毒配基、华蟾蜍精等成分的含量。方法样品经乙醇室温浸渍提取,采用HPLC法测定。色谱柱为DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-水(体积比为4∶1∶5),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为296 nm,柱温为40℃。结果蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精分别在0.0848~0.5088、0.0884~0.5304和0.2000~1.2000μg内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数r分别为0.9999、0.9992和1.0000。蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精的平均回收率分别为99.3%、99.6%和99.0%,RSD分别为0.5%、0.2%和0.6%(n=9)。结论HPLC法可用于蟾皮中蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精的含量测定。     

高效液相色谱法同时测定蟾酥中8种成分的含量

目的建立HPLC法同时检测蟾酥中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、远华蟾毒精和华蟾毒它灵8种成分的含量。方法采用Thermo Scientific C_(18)色谱柱(250mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水,梯度洗脱,检测波长296 nm,流速0.6 mL·min~(-1),柱温30℃,进样量10μL。结果 8个成分在对应线性浓度范围内与峰面积线性关系良好,精密度、稳定性和重复性的RSD均<5%,平均回收率在97.2%～99.8%。结论该含量测定方法操作简便、准确可靠,可用于蟾酥的质量控制。     

花背蟾蜍耳后腺分泌物中化学成分的研究

作者对花背蟾蜍耳后腺分泌物的药效研究结果表明,其强心、升压等作用主要来自其氯仿提取物,作者应用中、低压液相色谱法,首次对花背蟾蜍分泌物的化学成分行进了分离,经UV,IR,~1H-NMR,MS鉴定确定了其中5种成分。分别为胆甾醇(Cholesterol),南美蟾毒精(Marinobufagin),日蟾毒它灵(Gamabufotalin),远华蟾毒精(Telocinobufagin),阿根廷蟾毒精(Arenobufagin). 另外,花背蟾蜍耳后腺分泌物有特臭,作者用水蒸汽蒸馏法提取,GC-MS鉴定,对其挥发性成分进行了研究。     

干蟾皮及其炮制品的指纹图谱建立与化学模式识别

目的:建立干蟾皮生品及炮制品UPLC指纹图谱,并同时测定干蟾皮中指标性成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、沙蟾毒精-3-辛二醇辛酯的含量,通过化学模式识别控制干蟾皮质量。方法:干蟾皮的甲醇提取液的分析采用Waters Acquity UPLC BEH色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm),以乙腈-0.5%乙酸为流动相,梯度洗脱,流速为0.2 mL·min^-1,柱温为30℃,检测波长为296 nm。结果:12批生品和12批炮制品的总含量分别为3.18～4.69 mg·g^-1和0.91～2.77 mg·g^-1,指纹图谱中均有9个共有峰,相似度分别为0.963～0.991和0.692～0.988,主成分分析和聚类分析能很好地识别干蟾皮的生品和炮制品。结论:该方法稳定、可靠,可为干蟾皮的质量控制、炮制工艺,进一步开发研究提供科学依据。     

一测多评法测定六神丸中5种蟾毒配基类成分含量

目的：建立一测多评法测定六神丸中蟾毒配基类成分含量的分析方法,并验证此方法在六神丸中的可行性和适应性。方法：采用高效液相色谱法,以华蟾酥毒基（S）为内参物,建立日蟾毒它灵（A）、蟾毒它灵（B）、蟾毒灵（C）和脂蟾毒配基（D）的相对校正因子。分别采用外标法和一测多评法测定六神丸中5种蟾毒配基类成分的含量,并比较测定值和计算值之间的差异。结果：六神丸中蟾毒配基类成分间的相对校正因子分别为f_A/S=1.06,f_B/S=0.896,f_C/S=1.09,f_D/S=0.914,一测多评法的计算值与外标法的实测值的相对误差小于1%。结论：以华蟾酥毒基为内参物建立的相对校正因子准确、可行,一测多评法可用于六神丸中蟾毒配基类成分的质量评价。     

HPLC法同时测定FT-CS胶囊中4种有效成分的含量

目的建立同时测定Tegafur-Venenum Bufonis(FT-CS)胶囊中4种有效成分含量的方法,提高制剂的质量控制标准。方法采用HPLC法。色谱柱:Luna Phenyl-Hexyl柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-水(体积比60∶40);流速:1.0 mL.min-1;柱温:40℃;检测波长:296 nm;进样量:10μL。结果蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾毒精、替加氟能够达到基线分离;蟾毒灵质量浓度在1.1~21.0 mg.L-1内、脂蟾毒配基质量浓度在2.2~44.0 mg.L-1内、华蟾毒精质量浓度在2.0~40.0mg.L-1内、替加氟质量浓度在10.0~40.0 mg.L-1内与峰面积呈良好的线性关系;蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾毒精、替加氟的回收率分别为98.05%、99.92%、100.02%、101.56%,RSD分别为2.52%、1.19%、0.43%、1.74%。结论该方法可作为FT-CS胶囊的质量控制方法之一。     

酯蟾毒配基抑制人肝癌细胞体外增殖和迁移侵袭研究

本文旨在探讨酯蟾毒配基对人肝癌细胞增殖和迁移侵袭的影响及其相关机制。采用MTT比色法测定酯蟾毒配基对4种肝癌细胞的体外生长抑制作用,划痕实验和Transwell实验用来评估酯蟾毒配基对MHCC-97H细胞的迁移和侵袭能力,采用Western blot实验检测经不同浓度酯蟾毒配基处理后, MHCC-97H细胞内迁移侵袭相关蛋白的表达。结果表明,酯蟾毒配基能明显抑制肝癌细胞的体外增殖能力,其对MHCC-97H、HepG2、SK-Hep-1、Huh-7细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)值分别为0.55±0.06、2.83±0.24、5.25±0.49、14.89±2.28μmol·L^-1;酯蟾毒配基还能显著抑制MHCC-97H细胞的迁移和侵袭能力,且具有显著的浓度依赖性。MHCC-97H细胞中的整合素α2 (integrin α2)、整合素α6 (integrin α6)、整合素β1 (integrin β1)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶2 (mat...