骨髓间充质干细胞体内分化为肾小管上皮细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能否在体内分化为肾小管上皮细胞.方法 取SD雄性大鼠胫、股骨骨髓,密度梯度离心法分离MSCs,采用4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)进行标记.32只雌性SD大鼠复制缺血再灌注肾损伤模型后随机分为移植组和对照组,移植组于缺血45min后经下腔静脉注入用DAPI标记的MSCs,对照组注入等量的生理盐水.分别于术后1 d、2 d、3 d、4 d处死大鼠,留取肾组织,荧光显微镜观察移植的MSCs在肾组织中的分布,采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素(Ricinus communis agglurinin,RCA)对迁移入肾脏的MSCs分化状况进行鉴定.结果 移植组术后第三天肾组织内可见DAPI标记细胞,第四天DAPI标记细胞明显增多(P＜0.05),且多数DAPI标记细胞能结合RCA.对照组没有发现DAPI标记细胞.结论 移植的外源性MSCs能够迁移、定居于肾组织中并分化为肾小管上皮细胞.     

骨髓间充质干细胞修复损伤肾小管上皮细胞:可能与可行

背景:研究表明骨髓间充质干细胞在急性肾损伤后能够通过直接分化为肾小管上皮细胞而促进肾功能的恢复,其修复肾脏的作用机制尚不清楚,能否直接分化为肾小管上皮细胞,目前仍有争议.目的:观察骨髓间充质干细胞输注后急性肾衰竭小鼠肾功能改变,外源性骨髓间充质干细胞在肾组织的分布以及是否向肾小管上皮细胞分化.方法:骨髓间充质干细胞来源于绿色荧光蛋白转基因小鼠.8～10周龄的健康雌性昆白小鼠90只随机随机分为3组.急性肾衰竭组和骨髓间充质干细胞组注射顺铂建立急性肾衰竭模型,骨髓间充质干细胞组在建模后24 h经尾静脉输注绿色荧光蛋白转基因小鼠的骨髓间充质干细胞悬液.正常对照组不进行任何干预.建模后第1,4,7,14,28天测定血尿素氮和血肌酐,观察肾组织病理变化,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞在肾组织的分布,共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞的分化情况.结果与结论:骨髓间充质干细胞组顺铂注射4～14 d后,尿素氮、肌酐值比急性肾衰竭组明显降低(P < 0.01或P < 0.05).骨髓间充质干细胞组第4天肾组织中可见绿色荧光的绿色荧光蛋白细胞,分布在外髓质区肾小管,第7天仍可见少量荧光细胞,同时表达肾小管上皮特异性的功能蛋白megalin.结果提示骨髓间充质干细胞在损伤肾脏可直接分化为肾小管上皮细胞,并改善急性肾衰竭小鼠的肾功能.     

骨髓间充质干细胞修复损伤肾小管上皮细胞：可能与可行？

背景：研究表明骨髓间充质干细胞在急性肾损伤后能够通过直接分化为肾小管上皮细胞而促进肾功能的恢复,其修复肾脏的作用机制尚不清楚,能否直接分化为肾小管上皮细胞,目前仍有争议。目的：观察骨髓间充质干细胞输注后急性肾衰竭小鼠肾功能改变,外源性骨髓间充质干细胞在肾组织的分布以及是否向肾小管上皮细胞分化。方法：骨髓间充质干细胞来源于绿色荧光蛋白转基因小鼠。8～10周龄的健康雌性昆白小鼠90只随机随机分为3组。急性肾衰竭组和骨髓间充质干细胞组注射顺铂建立急性肾衰竭模型,骨髓间充质干细胞组在建模后24h经尾静脉输注绿色荧光蛋白转基因小鼠的骨髓间充质干细胞悬液。正常对照组不进行任何干预。建模后第1,4,7,14,28天测定血尿素氮和血肌酐,观察肾组织病理变化,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞在肾组织的分布,共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞的分化情况。结果与结论：骨髓间充质干细胞组顺铂注射4～14d后,尿素氮、肌酐值比急性肾衰竭组明显降低（P〈0.01或P〈0.05）。骨髓间充质干细胞组第4天肾组织中可见绿色荧光的绿色荧光蛋白细胞,分布在外髓质区肾小管,第7天仍可见少量荧光细胞,同时表达肾小管上皮特异性的功能蛋白megalin。结果提示骨髓间充质干细胞在损伤肾脏可直接分化为肾小管上皮细胞,并改善急性肾衰竭小鼠的肾功能。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

骨髓间充质干细胞的研究

骨髓间充质干细胞（MSCs)是骨髓中的非造血细胞，构成造血微环境，支持造血，具有向成骨细胞，软骨细胞，成肌/心肌细胞，脂肪细胞，神经元等分化的潜能，表达多种表面标记物，但不具特异性。骨髓，外周血的MSCs是一循环的整体，具有其自身代谢，更新的循环，终末分化可能跨越胚层界限，MSCs应用前景广阔。     

角化细胞生长因子对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肺泡上皮细胞的实验研究

目的观察角化细胞生长因子(KGF)对体外小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肺泡上皮细胞诱导分化的影响。方法建立体外非接触共培养诱导小鼠MSCs向肺泡上皮细胞分化的实验模型,并在培养液中加入KGF(10μl/ml),小鼠分4组(6只/组),实验组A:MSCs(1×105)单独培养组+KGF;实验组B:MSCs+正常肺组织悬液(1×105)+KGF;实验组C:MSCs+损伤肺组织悬液+KGF;实验组D:MSCs+损伤肺组织悬液(1×105)。共同培养8 d,应用激光共聚焦显微镜和RT-PCR检测共培养体系下室MSCs中的SP-C和AQP5的表达情况。结果实验组C于共培养的d 8,较其它实验组的AQP5 mRNA的表达量明显增多(5550.00±244.39vs1650.17±184.02,1600.83±193.00,2890.00±179.09,P均<0.05);于共培养的d 5,与实验组A相比差异也有统计学意义(1743.17±228.41vs1482.00±156.11,P<0.05)。只有实验组C和D表达SP-C,且实验组C各培养时间点的SP-C的mRNA的表达量均较实验组D明显增多(2632.50±231.11vs1599.00±158.95;3976.67±221.81vs2066.83±101.31;5388.33±347.96vs3893.17±178.61,P均<0.01)。结论KGF可以进一步促进体外小鼠MSCs诱导分化为肺泡上皮细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞的分化

目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的可行性。方法:实验于2004-10/2005-12在苏州大学儿科研究所和苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。骨髓间充质干细胞特性实验:①将2只4周龄SD大鼠断颈处死,无菌条件下取股骨、胫骨,去除其干骺端,暴露骨髓腔,DMEM培养液冲洗,混匀后用密度为1.077g/L淋巴细胞分离液分离。取单个核细胞层接种50mL细胞培养瓶进行培养,3d后首次换液,待10～14d细胞生长到80%～90%融合时以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化传代。②采用免疫荧光法测定骨髓间充质干细胞表面CD44与Vimentin的表达情况;应用二苯基四氮唑溴盐法检测细胞生长情况。损伤肾脏组织匀浆诱导骨髓间充质干细胞实验:①取1只成年SD大鼠麻醉后,表皮消毒,取腹部正中切口,寻及双侧肾蒂,用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂,缺血60min后松开动脉夹,再灌注60min后,无菌取肾制备匀浆。②将肾脏匀浆置于插入式嵌合培养皿中对第3代骨髓间充质干细胞进行诱导,并加入含有5μmol/L全反式维甲酸的最低必须培养基。③诱导第0,3,5,7天,倒置显微镜下观察细胞大体形态变化;以上各时间点取活细胞制成活细胞悬液,经流式细胞仪测定第18型角蛋白的阳性表达率;取诱导分化第7天的细胞,电镜观察其超微结构变化;钙钴法碱性磷酸酶细胞化学染色,与未经损伤肾脏组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞进行比较。结果:①骨髓间充质干细胞的特性检测:免疫荧光法鉴定分离培养的第3代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性。二苯基四氮唑溴盐法测得的细胞生长曲线呈倒“S”型。②损伤肾脏组织匀浆诱导后骨髓间充质干细胞情况:骨髓间充质干细胞经诱导后大体形态变圆,由梭形细胞逐渐转变为鹅卵石样细胞,细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。诱导第7天细胞出现微绒毛和紧密连接,经诱导后的骨髓间充质干细胞第18型角蛋白表达阳性率升至79.5%。结论:在缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆及全反式维甲酸的联合诱导下,骨髓间充质干细胞可向肾小管上皮样细胞分化,具有成为种子细胞应用于急性肾脏损伤治疗的潜在价值。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞的实验

目的：探讨新西兰兔骨髓间充质干细胞在体外不同条件下定向分化为阴茎海绵体平滑肌细胞的可行性。方法：实验于2004-10／2005-05在中山大学第二附属医院实验中心完成。采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞；分别通过添加血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子进行体外直接诱导以及与阴茎海绵体平滑肌细胞不同比例（根据骨髓间充质干细胞与阴茎海绵体平滑肌细胞数量比，共培养诱导分为4：1组、2：1组以及1：1组。每6孔作为1个诱导组，每孔兔骨髓间充质干细胞终浓度为1&;#215;10^8L^-1，阴茎海绵体平滑肌细胞相应终浓度分别为0.25&;#215;10^8L^-1、0．5&;#215;10^8L^-1及1&;#215;10^8L^-1）进行共培养两种方法诱导干细胞分化为阴茎海绵体平滑肌细胞。培养2d后的细胞爬片进行荧光免疫细胞化学染色测定抗α平滑肌肌动蛋白抗体表达，全程避光进行。完成染色后，立即进行激光共聚焦显微镜镜检。每孔爬片随机取5个视野，计算出每孔中Hoechst33342与FITC（或Cy3）双阳性细胞数及Hoechst33342单阳性的细胞数的比值以计算每孔的诱导率，应用SPSS软件进行完全随机设计的方差分析。结果：①阴茎海绵体平滑肌细胞的生长特性、形态及鉴定：组织块贴壁后细胞渐游出，呈梭形或长条形，原代细胞汇合90％约需16～19d，传代后生长加快，90％汇合时1：2传代后约3d可再次传代。细胞融合时呈现典型的“峰-谷”样形态。传至10代之后细胞生长放缓，胞体渐变宽大，胞内颗粒增多。荧光免疫细胞化学检测特异性抗α平滑肌肌动蛋白抗体见绝大部分细胞呈阳性。②直接诱导以及共培养诱导的初步分析结果：骨髓间充质干细胞之细胞核标记良好，诱导后见胞浆表达多量抗α平滑肌肌动蛋白抗体，与阳性对照组相似；高倍镜下可清晰见平滑肌肌动蛋白肌丝，而阴性对照组只有核显色，无抗α平滑肌肌动蛋白抗体表达。③不同组别诱导率方差分析S-N-K检验得各组总体均数差异性检验的（F=44．83l，P〈0．05），表明统计学上有显著性差异；共培养1：1组效率最高，依次是共培养2：1组、共培养4：1组，血管内皮生长因子组、血管内皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组最低，后两者间诱导效果在统计学上无差别。结论：骨髓间充质干细胞可通过添加生长因子和共培养的方法诱导分化为阴茎海绵体平滑肌细胞，其中以共培养的方法效率较高。     

Cbfal定向调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 研究核心结合因子(Cbfal)调控骨髓问充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞的分子机制。方法 用Percoll密度梯度离心法分离获得人、大鼠和小鼠的MSCs，通过HE、细胞化学、免疫细胞化学、免疫荧光及透射电镜等方法进行鉴定。传代培养后的MSCs分别用重组真核表达载体pcDNA3．1( )／Cbfal-Ⅱ通过脂质体系统转染，用Northern Blot检测三种成骨细胞特异性细胞外基质蛋白mRNA的表达情况。结果 转染后人、大鼠和小鼠的MSCs都有骨钙素、骨桥接蛋白和Ⅰ型胶原的表达，三者间无明显差别。结论 Cbfal在转录水平定向调控间充质干细胞分化为成骨细胞，可应用于骨科疾患的基因治疗。     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中端粒酶活性表达及意义

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞覆其扩增过程中端粒酶活性的表达及其意义。方法：联合应用密度梯度离心和贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞，继而诱导其向内皮细胞方向分化并传代培养。用TRAPezeELISA法和TRAP银染法分别检测骨髓问充质干细胞体外诱导分化前后端粒酶活性。结果：兔骨髓问充质干细胞体外培养时具有快速增殖能力，在特定环境中诱导分化细胞具有内皮细胞特征；增殖前的骨髓阃充质干细胞端粒酶活性低水平表达，一旦经过诱导分化其端粒酶活性表达上调，在5代内其端粒酶活性不因细胞传代而下降或消失。结论：骨髓间充质干细胞在体外有限扩增和诱导分化时保持端粒酶活性，维持组织干细胞特性，为内皮祖细胞的临床研究奠定理论基础。     

诱导骨髓间充质干细胞成肌分化时GDF-8表达的变化

目的探讨大鼠骨髓间充质千细胞（BMSCs）在体外诱导成肌分化时转化生长因子-8（GDF-8）表达的变化。方法原代培养后扩增的第5代BMSCs以5-氮胞苷（5-Azc）进行成肌诱导分化,用免疫荧光、逆转录定量聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫印迹（Western Blot）检测GDF-8的表达。结果体外诱导BMSCs成肌分化时免疫荧光检测发现,在不同时间点于绝大多数细胞的胞浆内都有明显的GDF-8表达,而没有用5-Azc处理的BMSCs则无表达,RT—PCR和Western Blot的检测也支持免疫组织化学的结果。结论在促使BMSCs向肌细胞分化的同时,细胞内同时也有抑制成肌分化的负性调节因子GDF-8的表达。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（hMSC）向造血细胞分化的可行性及分化条件。方法首先建立hMSC的分离培养扩增体系，制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液（FLSC-CM），将hMSC接种在分别含FLSC-CM和IL-6、SCF组合的培养体系中，通过形态学、直接免疫荧光染色检测法、粒-单／巨噬系集落形成细胞培养（CFU-GM）对分化细胞进行鉴定。结果hMSC经FISC—CM诱导培养9天后，产生较多的悬浮细胞，悬浮细胞瑞士染色后形态类似于单核或小淋巴细胞，表达人CD34和人CD45表面抗原。且能够形成造血祖细胞集落（CFU-GM）。结论FLSC-CM可诱导hMSC分化为具有造血干／祖细胞特性的前体细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外多向分化潜能特性的研究

目的研究体外不同诱导条件下成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞分化的能力。方法用细胞化学方法对诱导后的骨髓细胞进行脂肪细胞特异油红O染色；Von Kossa及改良的钙钴法进行成骨细胞鉴定；免疫组化方法检测诱导后的骨髓细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白-M(NF—M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果在不同的诱导条件下，诱导后的细胞油红O染色胞浆内可见橙红色脂滴；Von Kossa染色可见细胞间布满黑色颗粒，提示有矿化基质沉积；改良钙钻法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色。免疫组化染色显示向神经细胞方向诱导后细胞NSE( )、NF—M( )、GFAP(-)。结论成人骨髓间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化的研究

目的 探讨心肌细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向诱导分化的作用及其生物学特性.方法 取大鼠四肢骨髓,用细胞分离液通过密度梯度离心分离MSCs,并将MSCs进行原代培养和传代培养,将传2代MSCs用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)进行标记.采用胰蛋白酶消化法取乳鼠心尖部心肌细胞进行培养,并与标记的MSCs混合培养,光镜下观察其动态变化,并于第3日行免疫组化染色,第5日行电镜观察.结果 原代和传代的MSCs增殖迅速,其阳性率达(90.34±2.31)%,与平行对照组[(4.07±1.35)%]比较差异有统计学意义(P<0.01).与心肌细胞混合后,光镜下观察MSCs形态出现明显的变化,第3日BrdU标记阳性的MSCs胞质中肌动蛋白(actin)表达阳性.电镜下观察原始细胞内出现了不规则的肌小节样结构.结论 心肌细胞与MSCs的接触可有效诱导MSCs向心肌细胞定向分化.     

绿色荧光蛋白基因转染人骨髓间充质干细胞体外成脂肪诱导分化的研究

目的以逆病毒为载体将绿色荧光蛋白基因（EGFP）转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）,研究对其成脂肪诱导分化的影响。方法以逆病毒为载体将EGFP基因转染hMSC,流式细胞仪检测转染后hMSC的表面标记,并对转染EGFP的hMSC进行成脂肪诱导分化培养。结果转EGFP基因的hMSC/EGFP细胞与未转基因的hMSC在细胞形态及生长特点上无差异。转基因的hMSC细胞仍高表达CD29、CD44、CD105抗原,传代培养后可诱导形成脂肪细胞。结论转染EGFP基因对hMSC在体外成脂肪诱导能力无明显影响,EGF可以作为研究hMSC多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。     

成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向神经细胞分化的可能性。方法利用Per-coil梯度分离及贴壁筛选法分离培养和扩增MSCs；利用bFGF、化学诱导剂DMSO和BHA联合诱导MSCs向神经元转化，观察分化过程中细胞形态的变化，利用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测神经元特异性标志物的表达情况。结果经Perecoll梯度分离及贴壁筛选法获得了纯度较高的人MSCs，诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态，并且分别从mRNA和蛋白水平上证明诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和NF，不表达神经胶质细胞标记物GFAP。结论人MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞，这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

α- 玉米赤霉醇影响小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化简

背景：骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力,植物雌激素α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化可能有促进作用。 目的：探讨α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为6组：非诱导组加含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的 IMDM 普通培养基;空白诱导组仅加入等量成骨条件培养基（含0.1μmol/L 地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L 维生素C）;阳性对照诱导组加入等量成骨条件培养基及10-8 mol/L雌二醇;高、中、低α-玉米赤霉醇组分别加入成骨条件培养基及10-5,10-6,10-7 mol/L梯度浓度的α-玉米赤霉醇。倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT 实验测定细胞增殖状态绘制细胞生长曲线,酶联免疫吸附法测定碱性磷酸酶、骨钙素的表达。 结果与结论：非诱导组细胞呈长梭形,生长密集时有接触抑制,各诱导组的细胞增殖受促进,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞可重叠生长;非诱导组低表达碱性磷酸酶、骨钙素,低浓度（10-7 mol/L）α-玉米赤霉醇组和阳性对照诱导组高表达碱性磷酸酶、骨钙素,与空白诱导组相比,差异有非常显著性意义（P＜0.01）。结果说明α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,低浓度α-玉米赤霉醇可显著促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。而上调碱性磷酸酶、骨钙素的表达量可能是α-玉米赤霉醇诱导促进骨髓间充质干细胞骨向分化的作用机制之一。