5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

5-氮胞苷诱导骨髓问充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的可行性。方法分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代后,加入5-氮胞苷诱导24h,按照诱导浓度分为对照组、5μmol/L组、10μmol/L组、15μmol/L组4组,培养4w,倒置显微镜观察形态变化,有无自发搏动,在第1、2、3、4w行细胞免疫组化检测α-Actin、Connexin43表达。结果 5-氮胞苷浓度10μmol/L组为适宜诱导浓度,5μmol/L组浓度不能达到诱导分化作用,15μmol/L组细胞死亡率高。未观察到心肌样细胞的单个搏动或多个同步搏动。结论经过5-氮胞苷诱导后的心肌样细胞在形态和结构特性上均与心肌细胞相似,但由于5-氮胞苷为细胞毒性药物,其应用于临床的安全性有待商榷。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的方法。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代细胞培养48h，分为4组：A组加入心肌组织块条件培养液、B组加10μmol／L 5-氮胞苷（5-aza）、C组为二者的混分液、D组不加任何诱导剂以作对照组。应用免疫细胞化学方法检测各组心肌特异性蛋白α-actin的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示，A组细胞培养3周时可检测到α-actin阳性细胞，阳性细胞较多；B组培养1周可见弱阳性细胞，随时间延长，阳性着色增强且阳性细胞数增多，3周时呈强阳性表达；C组2周即可检测到细胞呈强阳性着色。对照组MSCs胞浆内未检测到α-actin的表达。4个组的阳性细胞率进行两两比较均有统计学意义（P〈0.05）。结论心肌组织块条件培养液和5-aza联合应用可促进MSCs体外分化为心肌样细胞。     

丹酚酸B体外干预骨髓间充质干细胞分化过程中cTnT的表达

[目的]观察丹酚酸B(SalB)体外干预骨髓间充质干细胞(MSCs)后细胞形态及心肌特异性蛋白肌钙蛋白T(cTnT)的表达。[方法]培养、纯化及鉴定MSCs,用SalB、5-氮胞苷组(5-aza)、SalB联合5-aza(SalB+5-aza)分别定向诱导分化,观察此过程中MSCs的形态学变化并采用免疫细胞化学法鉴定诱导后MSCs心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达。[结果]诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示诱导后MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT。[结论]SalB在体外定向诱导MSCs分化为心肌细胞的过程中发挥了一定的作用。     

5-氮胞苷诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化成肌细胞

目的：观察并检测5-氮胞苷（5-Aza）诱导大鼠脂肪间充质干细胞（AMSCs）分化成肌细胞的过程中,细胞形态及相关基因、蛋白的表达情况,探讨5-Aza对大鼠AMSCs分化的诱导作用．方法：分离大鼠AMSCs,在含有10μmol／L5-Aza的培养液中培养,观察细胞形态的变化,并通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测诱导后MyoG的表达,免疫细胞化学染色法检测诱导后Desmin和α-Sarcometric Actin的表达．结果：用10μmol／L 5-Aza诱导后,细胞形态逐渐伸展变长,呈现肌细胞形态;RT-PCR结果显示,诱导后15h左右开始表达MyoG;免疫细胞化学染色结果显示,诱导10d后Desmin染色呈弱阳性,14d阳性程度增强,且此时部分细胞开始表达α-sarcomeric Actin,并随时间延长表达增强,至28d呈强阳性．结论：采用10μmol／L 5-Aza可以诱导大鼠AMSCs向肌细胞分化．     

5-氮胞苷对大鼠脂肪间充质干细胞的诱导分化作用及相关蛋白的表达

目的 探讨5-氮胞苷(5-Aza)对大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的诱导分化作用及相关蛋白的表达。 方法 采取酶消化法和贴壁法分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠腹部皮下脂肪组织，采用抗单核细胞人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、兔抗CD13、CD44、CD105、血管性血友病因子(vWF)多克隆抗体对培养细胞进行鉴定，排除造血干细胞及成纤维细胞，取第3代ADMSCs细胞，以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中，并将其随机分为正常组和诱导组，正常组细胞于常规培养基中加入无菌生理盐水培养，诱导组细胞于常规培养基中加入浓度为10 μmol/L的5-Aza进行诱导培养。比较2组细胞的形态结构、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)及缝隙连接蛋白43(Connexin43)基因表达量及cTnT、cTnI、Connexin43蛋白的表达情况。 结果 诱导组ADMSCs细胞增殖缓慢，体积增大并逐渐变为棒状或宽梭形，形态呈心肌细胞特征；RT-qPCR结果显示，诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43基因表达量增强；免疫组化结果显示，诱导组细胞细胞质明显可见棕黄色或棕褐色颗粒物质，而正常组细胞细胞质中棕黄色或棕褐色颗粒物质较少，且诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43蛋白阳性表达评分明显高于正常组(P<0.05)。 结论 大鼠脂肪组织中含有多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)，5-Aza可以诱导大鼠ADMSCs向心肌细胞分化，ADMSCs有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。      

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的：研究大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)离体分离和培养方法,诱导MSCs向神经细胞样细胞分化。方法：通过梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞,进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化MSCs,对其生长特性进行分析。分别用硫代甘油和β-巯基乙醇对MSCs诱导分化,观察细胞形态变化,免疫组化检测分化细胞中nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,进行鉴定。结果：用含15％胎牛血清(FCS)的L—DMEM培养MSCs,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,生长特征呈“S”形,有较强的增殖能力,于第10代以后开始出现衰老征象。MSCs经硫代甘油和巯基乙醇诱导分化后,细胞形态发生改变,nsetin,NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论：大鼠MSCs可以离体分离,培养,并能诱导向神经细胞样细胞分化。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离及5-氮胞苷对其的诱导分化作用

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（SD—MSCs）体外分离的方法条件、生物学特性及5-氮胞苷对其的诱导分化作用。方法采用全骨髓贴壁法分离培养SD—MSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪对其细胞周期进行分析,并通过成脂肪诱导鉴定,给予5-氮胞苷进行诱导分化,通过免疫组化和蛋白免疫印迹法．观察其对超极化激活环核苷酸门控的通道蛋白（HCN2）表达情况。结果SD—MSCs以长梭形和多角形为主,呈放射状集落生长,细胞生长曲线呈S形,增殖能力比较活跃。成脂肪诱导后,细胞胞质内有大量橙红色脂滴形成。不同浓度的5-氮胞苷对SD—MSCs进行诱导分化后,7．5、10、12．5umol／L5-氮胞苷诱导的HCN。表达阳性强度较高,其中101umol／L的5-氮胞苷诱导24h的SD—MSCsHCN。表达强度最高。结论全骨髓贴壁法能够有效分离纯化增殖SD—MSCs,5-氮胞苷能够诱导其分化为HCN2表达阳性的细胞。     

5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的毒理遗传学研究

目的：观察5-氮胞苷（5-aza）对成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌细胞方向诱导分化的毒理遗传学影响.方法：自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs,用5-aza对ADMSCs进行诱导,设立不同诱导浓度的I,II,III,（5,10,20μmol/L）组及对照组IV,光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化,免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白I（cT-nI）,RT-PCR方法检测cTnI基因的表达,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,并对各诱导组常规核型分析.结果：诱导后4wk I,II,III组ADMSCs呈现类似心肌细胞的形态学特征.I,II,III组免疫组化结果见cTnI阳性表达,RT-PCR条带见cTnI基因表达.各组染色体结构及数目均未见异常.结论：5-aza作为诱导剂对ADMSCs遗传性无不良影响.     

5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞向肌细胞增殖及分化的影响

目的：探讨在不同浓度5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞过程中，其对干细胞增殖及分化的影响。方法：分离纯化鉴定4周龄Wistar大鼠骨髓MSCs，以不同浓度5-Aza作用，用四唑盐（MTT）法测定细胞生长活力，观察细胞形态变化，通过RT-PCR及电泳测定诱导后大鼠的MSCs中骨骼肌肌动蛋白的表达。结果：0和1 μmol·L^-1 5-Aza对细胞增殖无明显影响；随着5-Aza浓度的增高，MSCs的增殖逐渐减弱；20~30 μmol·L^-1 5-Aza对细胞有毒性作用，影响其增殖。3和6 μmol·L^-1 5-Aza，MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达；9和12 μmol·L^-1 5-Aza，MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达，该浓度作用9 d后有部分细胞体明显增粗，12 d有肌管样细胞出现。结论：5-Aza影响干细胞分化，调控基因的表达及调控MSCs向肌细胞定向分化为肌管样细胞的过程。     

5-氮胞苷联合丹酚酸B促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

[目的]探讨5-氮胞苷及丹酚酸B的联合作用下骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞的能力。[方法]体外分离、培养、鉴定的骨髓MSCs分为4组:正常对照组,5-氮胞苷组,丹酚酸B组,5-氮胞苷+丹酚酸B组。诱导2周后,利用实时荧光定量PCR(QPCR)和蛋白免疫印迹技术检测心肌早期转录因子(GATA-4)和心肌特异性肌凝蛋白重链(α-MHC)的表达含量。[结果]各诱导组GATA-4及α-MHC RNA和蛋白的表达量均高于正常对照组,而5-氮胞苷+丹酚酸B组高于5-氮胞苷组和丹酚酸B组,且差异有统计学意义。[结论]5-氮胞苷联合丹酚酸B可提高MSCs向心肌样细胞的分化率。     

骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

随着组织工程学的不断发展，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）被研究证明可以诱导分化为多种组织细胞．尤其是在骨组织工程中得到了很好的应用．有望成为骨组织工程重要种子细胞来源。     

黄芪注射液与5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究

目的研究黄芪注射液与5-氮杂胞苷（5-Aza）对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化为心肌细胞的影响。方法在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs。以1：3的比例传代,取第3代的细胞．接种后随机将MSCs分为黄芪注射液诱导分化组、5-Aza诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组。分别以黄芪注射液、5-Aza及黄芪注射液＋5-Aza进行诱导,用相差显微镜观察各纽细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白I。结果各组诱导后细胞形态发生改变,细胞之问形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白I（eTnI）表达均阳性。黄芪注射液组与5-Aza组相比其诱导率无明显区别．但黄芪注射液＋5一Aza组阳性细胞比率均高于5-Aza组及黄芪注射液组．差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方法优于单纯采用黄芪注射液或5-Aza谤导法。     

腺病毒表达载体对骨髓间充质干细胞分化能力的影响

目的 研究腺病毒感染骨髓间充质干细胞(MSC)对MSC分化潜能的影响.方法 利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒感染传至3代的人MSC,分别在感染后第2、4、8和16天收集细胞,提取总RNA,利用RT-PCR检测感染前后MSC中内胚层标志基因CYP51、中胚层标志基因SM22α、外胚层标志基因槽蛋白(nestin)、多分化潜能标志基因OCT4和可变剪切因子基因nPTB的表达.在腺病毒感染MSC 7 d后,利用成脂肪诱导剂继续诱导培养14 d,用油红O染色观察MSC向脂肪细胞分化情况.结果 RT-PCR检测显示,MSC中CYP51、SM22α、nestin、OCT4和nPTB在腺病毒感染后2、4、8和16 d时仍有表达.腺病毒感染7 d后的MSC仍可向脂肪细胞分化,且分化效率同正常MSC一致.结论 腺病毒载体感染MSC后,不会影响MSC的分化能力,可以作为MSC诱导分化机制研究的基因表达载体.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的实验研究

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSC),并诱导其向神经元细胞分化.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养,并通过诱导培养基进行体外诱导培养,比较对照组及实验组间细胞形态和神经丝蛋白(NFP)表达率的不同.结果:诱导后,实验组中80%的细胞表现出神经元样形态,且NFP阳性表达率明显高于对照组.结论:MSC在体外可以被诱导为神经元样细胞.     

5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞向肌细胞增殖及分化的影响

目的:探讨在不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞过程中, 其对干细胞增殖及分化的影响。方法:分离纯化鉴定4周龄Wistar大鼠骨髓MSCs,以不同浓度5-Aza作用,用四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力,观察细胞形态变化,通过RT-PCR及电泳测定诱导后大鼠的MSCs中骨骼肌肌动蛋白的表达。结果:0和1 μmol·L-1 5-Aza对细胞增殖无明显影响;随着5-Aza浓度的增高,MSCs 的增殖逐渐减弱;20～30 μmol·L-1 5-Aza对细胞有毒性作用,影响其增殖。3和6 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达;9和12 μmol·L-1 5-Aza,MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达,该浓度作用9 d后有部分细胞体明显增粗,12 d有肌管样细胞出现。结论:5-Aza影响干细胞分化,调控基因的表达及调控MSCs向肌细胞定向分化为肌管样细胞的过程。     

γ干扰素体外诱导骨髓间充质干细胞的IDO表达及其免疫调节作用

探讨γ干扰素（IFN-γ）体外诱导作用成人骨髓间充质干细胞（MSCs）的吲哚胺2，3-过氧化酶（IDO）的表达及IDO对异基因T淋巴细胞增殖的影响。从人骨髓中分离、培养MSCs，观察传代3次以上的细胞形态，应用流式细胞术检测其表面标志，以鉴定其纯度。分别用浓度为O、20、50、100、200U／ml的IFN-γ诱导作用MSCs后，以逆转录聚合酶链反应检测IDO mRNA的表达，蛋白印迹法检测IDO蛋白的表达，反相高效液相色谱法检测色氨酸的特异代谢产物犬尿氨酸的特异代谢率，