构建玻片蛋白质芯片的实验研究

目的:探讨玻片蛋白质芯片的构建方法及其中间操作条件的选择与优化。方法:利用生物芯片点样仪将超微量蛋白质点到经特殊处理的玻璃片表面,然后选用不同的化学试剂对玻片背景进行封闭;再用荧光素标记的蛋白质与点样蛋白杂交;最后用生物芯片分析仪扫描成像并进行分析,比较不同条件下芯片的显示效果。结果:蛋白质样品与片基稳定结合,并保持原活性状态;封闭试剂选用酪蛋白或明胶效果较佳;点样探针与其特异蛋白质抗体可稳定结合,结合效果与点样蛋白浓度在一定范围内呈正相关;在1.6 cm×1.6 cm的玻璃片面积上,构建了36×36=1269点的蛋白质芯片。结论:本实验条件下,蛋白质抗原或抗体可以稳定地固定于经过处理的玻璃片表面.制成免疫型蛋白芯片,并可通过随后的抗原抗体反应与荧光素标记的相应抗体或抗原结合,用生物芯片分析仪可对其荧光信号进行检测分析。     

碳纳米管表面的蛋白质吸附及PEG修饰研究

血浆蛋白中的纤维蛋白原分子和白蛋白分子在碳纳米管表面的吸附行为，通过不同分子量聚乙二醇对它表面修饰后可以在一定程度上抑制一定浓度范围内的纤维蛋白原分子的非特异性结合。     

基于直接标记法抗体微阵列的初步构建

目的:初步构建基于直接标记法的抗体微阵列,并评价其应用于临床的可能性. 方法:选择白蛋白作为目标蛋白,通过琼脂糖铺片、玻片活化、机器点样、点样后固定等步骤构建抗体微阵列,经封闭非特异位点、标记抗原、加样后对白蛋白进行检测,对关键步骤--抗原标记进行最佳条件摸索,通过对临床标本的检测评价其潜在应用价值.结果:应用BCA蛋白定量试剂盒测定尿液样本总蛋白浓度做出的标准曲线,其R2均大于0.99;温度为37 ℃时抗原标记效果最佳;标记后抗原存放1周对信号的影响无统计学意义(P＜0.01);本方法能够检测出临床检测为阴性的尿微量白蛋白浓度.结论:本研究构建了基于直接标记法的抗体微阵列,并对关键的抗原标记环节进行了最佳工作条件优化,有应用于临床检测的潜力.     

导致玻片法ABO血型鉴定错误的结果分析

目的 探讨玻片法ABO血型鉴定的不同加样方式对结果的影响.方法 采用传统玻片法(下称传统法)对笔者所在医院1992～1997年门诊、急诊、住院患者进行ABO血型鉴定;采用改良玻片法(下称改良法)对1998～2003年门诊、急诊、住院患者进行ABO血型鉴定;采用标准玻片法(下称标准法)对2004～2010年住院患者进行ABO血型鉴定;采用改良玻片法对2004～2010年门诊、急诊患者进行ABO血型鉴定.结果 1992～1997年传统法导致ABO血型鉴定的错误率为5.35/10万;1998～2003年改良法导致ABO血型鉴定的错误率为1.58/10万;2004～2010年标准法导致ABO血型鉴定的错误率为1.03/10万;2004～2010年改良法导致ABO血型鉴定的错误率为1.46/10万.经统计学分析,传统法ABO血型鉴定的错误率与标准法ABO血型鉴定的错误率差异有统计学意义(P<0.05),改良法ABO血型鉴定的错误率与标准法ABO血型鉴定的错误率差异无统计学意义(P>0.05).结论 应用改良玻片法进行ABO血型鉴定是可行的,可广泛应用于门诊、急诊、住院患者的ABO血型鉴定.     

cDNA微阵列和组织微阵列对卵巢上皮性肿瘤基因的表达

[目的]结合cDNA微阵列和RNA与冰冻组织微阵列原位杂交的方法以寻找新的特异性卵巢癌候选癌基因,为卵巢癌的早期诊断和治疗提供理论依据.[方法]利用cDNA微阵列筛选在所有3种上皮性卵巢肿瘤中(卵巢浆液性交界性肿瘤、卵巢浆液性腺癌和卵巢子宫内膜样腺癌)显示有意义表达的基因,由RNA与冰冻组织微阵列原位杂交证实其结果.[结果]28个基因在＞70%卵巢肿瘤中显示出高表达,18个基因在＞70%卵巢肿瘤中低表达;干扰素诱导的转膜蛋白1(ⅡTP1)被进一步用于RNA与冰冻组织微阵列原位杂交研究,其结果与cDNA微阵列研究结果相符合.[结论]将cDNA微阵列和RNA与冰冻组织微阵列原位杂交相结合是寻找卵巢癌候选癌基因的可行方法,研究中显示有意义表达的基因有可能作为新的上皮性卵巢癌候选癌基因.     

采用cDNA微阵列杂交技术对垂体瘤基因表达谱的研究

目的应用cDNA微阵列杂交技术筛选垂体瘤组织差异表达基因,并初步讨论了差异表达基因在垂体瘤发病过程中的作用。方法用cDNA微阵列技术筛选垂体瘤组织差异表达基因,对于在3种垂体瘤中高差异表达基因用RTPCR和实时定量PCR进行初步验证。结果用cDNA微阵列技术筛选垂体瘤组织差异表达基因按照基因功能分类,发现差异表达的基因主要与信号转导相关和发育、分化相关。PP4R2,GHRHR和clusterin分别在泌乳素瘤,生长激素瘤,无激素瘤中明显高表达,并经RTPCR,实时定量PCR等证实。结论PP4R2,GHRHR,clusterin可能分别在泌乳素瘤,生长激素瘤,无激素瘤的发生发展中发挥了重要作用。     

多囊卵巢综合征患者血清中MDA修饰蛋白抗体的研究

目的：研究多囊卵巢综合征（PCOS）患者血清MDA修饰蛋白、抗子宫内膜抗体（EMAb）MDA修饰人血清白蛋白抗体（anti-HAS-MDA）是否较正常人高,同时探讨EMAb的特异性是否与氧化应激衍生物——过氧化物修饰蛋白有关。方法：PCOS患者20例,对照组20例,抽取静脉血取血清,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测EMAb和anti-HAS-MDA,比色法检测MDA修饰蛋白,统计EMAb是否与anti-HAS-MDA相关。结果：PCOS患者EMAb、anti-HAS-MDA和MDA修饰蛋白比对照组显著增高,且EMAb和anti-HAS-MDA的变化呈正相关。结论：PCOS患者血清中EMAb、MDA修饰蛋白的升高,证实在PCOS患者中氧化应激损伤和自身免疫反应的存在;anti-HAS-MDA和EMAb的升高呈正相关说明EMAb的特异性可能与过氧化物修饰蛋白有关,提示PCOS患者体内氧化应激损伤和自身免疫反应的内在联系。     

同步检测两种输血传播病原体的蛋白微阵列的研究

目的建立一种基于多元蛋白微阵列的免疫检测方法,用于筛查人血清中艾滋病毒、丙型肝炎病毒。方法将HIV/HCV抗原喷印到活化的玻片表面,抗原与活化基团共价结合后与血清中的特异性抗体反应,用激光芯片扫描系统对蛋白微阵列进行扫描成像。所获得的图像用软件进行分析,并自动判定并生成待测样本的定性结果。结果蛋白微阵列法检测HIV、HCV两种定值血清检测限分别为：12ng/ml、5ng/ml。运用该系统检测HIV、HCV两种抗体参比品,各检测项目的符合率分别为87.5%、93.75%。结论多元蛋白微阵列法特异性强,灵敏度、准确度、精密度较高,具有应用和推广价值。     

血清缺血修饰蛋白对冠心病诊断价值的研究

目的探讨缺血修饰蛋白（IMA）在冠心病心肌缺血诊断中的价值。方法2009年11月至2010年5月,随机入选72例因临床疑诊冠心病心肌缺血而在我科住院治疗、且准备接受冠状动脉造影检查的患者。根据造影结果将患者分为冠心病组与非冠心病组,造影术前利用白蛋白结合钴试验（ACB试验）检测IMA水平。将冠状动脉造影结果作为诊断标准,采用受试者工作特性曲线（ROC曲线）下面积以及logistic回归分析IMA对冠心病心肌缺血诊断的价值。结果冠心病绀患者（51例）的缺血修饰蛋白水平为（97±24）U／ml,非冠心病组（21例）患者的IMA水平为（81±15）U／ml。当IMA的截断值为83．69U／ml时,其诊断冠心病心肌缺血的敏感性为80％,特异性为57％,阳性预测值为82％,阴性预测值为55％。logistic回归分析显示,高血压（P=0．022,b=1．421,OR=4．141）、IMA水平（P=0．003,b=1．780,OR=5．928）是冠心病心肌缺血发生的独立预测凶于。结论IMA水平在诊断冠心病心肌缺血方面具有较高的敏感性及阳性预测值,是冠心病心肌缺血发生的独立预测因子。     

细菌玻片凝集实验替代诊断血清的研究

目的 节约实验经费，并解决沙门氏菌因培养时间不同，导致有时O凝集与H凝集不能同时出现的问题。方法 用鞣钙液或鞣酸溶液代替诊断血清与各种沙门氏菌、志贺氏菌做玻片凝集。结果 沙门氏菌、志贺氏菌均在1Inin内出现满意的凝集结果。结论 本法可作为沙门氏菌、志贺氏菌凝集反应的模拟方法，可经济有效地开出有关的免疫学实验。     

构建新型细胞芯片的初步研究

目的:设计一种全新概念的细胞芯片.方法:将CD3,CD4,CD8抗体固定于醛基玻片上,形成3×3阵列,从全血中分离出的单个核细胞与之反应,形成选择性细胞群.将细胞芯片进行扫描电镜观察,台盼蓝染色,瑞氏染色,CD3-Cy5 CD4-FITC CD8-RPE三色荧光染色并观察结果.结果:电镜照片显示所结合淋巴细胞外形完整,细胞膜表面有呈皱折状突起,还可见散射状的细长毛状突起.台盼蓝染色显示活细胞数＞95%;瑞氏染色细胞形态良好,杂交点边缘整齐,背景干净;荧光染色显示特异性良好.结论:本实验能根据细胞表面不同的免疫标志进行细胞分群,可为以后制作大规模、高通量的细胞芯片做准备,并提出了全新意义的细胞芯片模型.     

基于琼脂糖膜为载体的抗体芯片工作条件的优化

目的:优化以琼脂糖修饰的玻片为载体的抗体微阵列的制备方法,提高微阵列信噪比及检测灵敏度。方法:选取单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)作为待检的靶蛋白,在琼脂糖膜上首先固定MCP-1捕获抗体,经过洗涤、封闭,然后依次加入标准抗原、生物素标记的检测抗体以及亲和素标记的cy3,分别孵育、洗涤后,激光共聚焦扫描仪扫描获取图像,分析各点的荧光强度,根据荧光强度确定捕获抗体的最佳固定时间、温度以及最适宜的洗涤缓冲液。结果:与4、37℃过夜固定相比,捕获抗体室温(25℃左右)过夜固定时,蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高;捕获抗体过夜固定比固定2 h获得更高的检测灵敏度;另外,通过比较相同pH值不同溶质缓冲液的洗涤效应,pH 7.4的缓冲液PBST可获得更优信号强度。结论:本研究优化了以琼脂糖修饰的玻片为载体的蛋白质微阵列的反应条件,提高了微阵列的检测灵敏度。     

Detection of cytokine expression patterns in the peripheral blood of patients with acute leukemia by antibody microarray analysis

The cytokines of acute leukemia （AL） patients have certain expression patterns, forming a complex network involved in diagnosis, progression, and prognosis. We collected the serum of different AL patients before and after complete remission （CR） for detection of cytokines by using an antibody chip. The expression patterns of cytokines were determined by using bioinformatics computational analysis. The results showed that there were significant differences in the cytokine expression patterns between AL patients and normal controls, as well as between acute myeloid leukemia （AML） and acute lymphoblastic leukemia （ALL）. In confirmatory test, ELISA revealed the expression of uPAR in AL. Moreover, the bioinformatic analysis showed that the differentially expressed cytokines among the AL groups were involved in different biological behaviors and were closely related with the development of the disease. It was concluded that the cytokine expression pattern of AL patients is significantly different from that of healthy volunteers. Also, differences of cytokine expression patterns exist between AML and ALL, and between before and after CR in the same subtype of AL, which holds important clinical significance for revealing disease progression.     

利用基因芯片技术筛选不同转移能力骨肉瘤细胞差异表达基因

目的：运用基因芯片技术研究骨肉瘤转移相关基因表达．方法：提取具有不同转移特性的骨肉瘤细胞总RNA，反转录制备杂交探针，应用基因芯片筛选与骨肉瘤转移相关的基因．杂交信号用ScanArray3000扫描，结果用ImaCene3．0软件分析．结果：对原位及转移骨肉瘤细胞基因表达诺分析，发现两种肿瘤细胞中存在差异表达基因，其中有抑癌基因、转移相关蛋白基因、细胞周期蛋白基因等，与肿瘤发生发展密切相关．结论：基因芯片技术对肿瘤转移机制研究有重要意义。     

肿瘤转移相关基因的表达谱研究

目的：运用基因表达谱芯片技术对肿瘤转移相关基因的表达谱进行研究。方法：对临床切除的肝癌和胰腺癌组织及相应的对照正常组织进行总ＲＮＡ抽提,纯化后的ｍＲＮＡ进行逆转录制备杂交探针,应用ＢｉｏＤｏｏｒ４０９６和ＢｉｏＤｏｏｒ１２８００的全长基因ＤＮＡ芯片筛选与肝癌和胰腺癌转移相关的基因。杂交后的信号用ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００扫描,结果用ＩｍａＧｅｎｅ３．０软件分析。结果：对肝癌和胰腺癌基因表达谱进行分     

红细胞抗体检测方法的研究

目的:比较几种抗红细胞单抗检测方法的效果。方法:用ELlSA方法和红细胞凝集试验分别对阴阳对照血清,单抗培养上清进行检测,并进行特异性、灵敏度和重现性结果对比。结果:几种方法结果表明,ELISA方法更灵敏,但反应时间长,过程复杂,需特殊仪器操作;而凝集试验方法简单,可在短时间直接观察结果,但灵敏度不高。结论:细胞膜包被的ELISA方法和微板凝集试验相结合,在大幅缩短反应时间的基础上,同时具有较好的灵敏度和特异性,值得在研究中推广使用。     

利用末梢血检测肺炎支原体IgM抗体的研究

目的 :研究利用末梢血检测肺炎支原体 (MP)IgM抗体的可行性。方法 :利用ELISA法检测 117例肺炎患儿静脉血及末梢血肺炎支原体IgM抗体 ,对其定性检测结果进行比较 ,并对MPIgM抗体值在 2 0 0～ 30 0 0u/ml范围内的 90例患儿的静脉血和末梢血MPIgM抗体水平进行比较 ,进行直线相关及直线回归分析。结果 :117例患儿静脉血和末梢血MPIgM抗体定性检测结果无显著差异 ,P >0 0 5。 90例患儿末梢血组MPIgM抗体水平 ( 912 5 3± 5 48 45u/ml)显著低于静脉血组 ( 10 2 4 0 2± 6 0 4 90u/ml) ,P <0 0 0 1,但二者具有高度相关关系 ,r =0 975。建立了以末梢血MPIgM抗体值为自变量 (x)的估测静脉血MPIgM抗体值 (y)的回归方程为 :y =46 +1 0 6 8x。结论 :利用末梢血检测肺炎支原体IgM抗体是可行性。     

细胞膜表面标志CD系列抗体蛋白芯片制备及应用的研究

目的：本研究利用抗原抗体免疫反应的原理，研制一种可同时快速检测多种蛋白的蛋白芯片，用于细胞膜表面抗原的检测。方法：将抗细胞表面标志CD抗原的CD系列抗体蛋白固定在醛基玻片上形成微阵列，从样品细胞中抽提膜蛋白抗原并用FSE标记，然后与固定在芯片上的CD抗体阵列反应，扫描仪检测反应结果。结果：本研究选用HL－60，K562，NB4，Jurkat细胞株为代表，测定到细胞膜表面蛋白质CD抗原HL－60，K562，NB4，Jurkat细胞CD13均为阳性，HL－60，NB4，Jurkat细胞CD4阳性，NB4细胞CD38阳性，K562细胞CD7阳性。所得结果与免疫印迹及免疫组织化学验证等方法一致。结论：HL－60，K562，NB4，Jurkat细胞膜表面蛋白质CD抗原有差异。蛋白芯片方法具有的高信息通量，低成本，制备，制定快速简单的优点，展示了良好的应用前景。