胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元的原代培养

目的建立用自制的鼠尾胶原联合胰酶消化法原代培养SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元。方法采用出生3 d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,通过胰酶消化后在自制鼠尾胶原包被的培养皿中进行原代培养,应用神经微丝蛋白进行免疫组化鉴定。结果获得的螺旋神经元细胞在体外能较快地贴壁,可以存活、生长,细胞形态良好。结论自制鼠尾胶原联合胰酶消化的培养方法可获得良好状态的螺旋神经元细胞,为原代培养螺旋神经元提供了新思路。     

一种改进的大脑皮层神经元原代培养方法的研究

目的:建立1种简单、高效的新生乳鼠大脑皮层神经元原代培养的方法。方法:出生12 h以内的SD乳鼠为研究对象,采用胰酶消化和机械分离法相结合制备细胞悬液;在细胞培养过程中,不加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞生长,而是用2%B27 Neurobasal A medium维持培养。结果:神经元生长良好,形成神经元网络系统;通过神经元免疫组织化学鉴定神经元纯度达90%以上。结论:此方法是获得纯度较高的神经元的1种可靠方法。     

Ser~(202)/Thr~(205)位点磷酸化tau在神经元中的定位

目的观察Ser202/Thr205位点的过度磷酸化tau在神经元中的定位和聚集情况。方法取孕18 d SD胎鼠皮层神经元进行原代培养,于培养第9天加入冈田酸(okadaic acid,OA)处理12 h以诱导tau蛋白磷酸化;同时用OA诱导SH-SY5Y细胞;观察tau磷酸化后神经元形态的变化;用AT-8抗体免疫荧光染色观察Ser202/Thr205位点磷酸化tau的定位和聚集;同时应用AT-8抗体和Tau-5抗体检测tau蛋白Ser202/Thr205位点的磷酸化水平变化情况。结果经过Anti-NeuN和Anti-GFAP免疫染色鉴定,孕18 d胎鼠皮层神经元选择性原代培养成功。OA处理12 h以后,Ser202/Thr205位点磷酸化tau的水平明显增加,且出现高分子量的寡聚体;免疫荧光染色发现,Ser202/Thr205位点磷酸化的tau在原代培养神经元的胞质聚集;而OA处理的SH-SY5Y细胞,Ser202/Thr205位点磷酸化的tau却定位于细胞核。同时发现OA处理的原代神经元突起明显减少或消失。结论 OA能够诱导原代培养的胎鼠神经元tau蛋白在Ser202/Thr205位点过度磷酸化,且该磷酸化tau在不同类型或来源的神经元中的定位不同。     

大鼠胚胎小脑提取液对体外培养小脑神经细胞的作用

目的　观察不同胎龄大鼠小脑提取液 (cerebellum extracts,CE)对体外培养小脑神经细胞的影响。方法　制备不同蛋白浓度的 14、16、18、2 0 d胎鼠 (E14、E16、E18、E2 0 )及新生 1d鼠 (P1) CE,加入原代培养的E18胎鼠小脑神经细胞中 ,2 4h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果　实验组各胎龄 CE均能促进培养小脑神经元的存活 ,并有蛋白浓度依赖关系 ,各胎龄都有各自不同的最适浓度 ,E16和 E18CE显示了更强的神经营养活性 ,与对照组及其他实验组相比差异有极显著性 (P<0 .0 0 1)。结论　 CE对培养小脑细胞具有高度神经营养活性。     

粉防己碱对喹啉酸致海马神经元损伤的保护作用

目的研究粉防己碱(Tet)对喹啉酸(QA)诱导原代培养乳鼠海马神经元兴奋毒损伤的保护作用。方法乳鼠海马神经元原代培养后用QA诱导损伤,MTT法测定细胞活力,同时测定培养上清中LDH活性,神经元病理染色后进行形态学观察。结果Tet(10-6mol·L-1和10-7mol·L-1)能明显提高QA损伤后原代培养乳鼠海马神经元的细胞活力,降低其上清液中LDH活性,与模型组相比,差异均有显著性(P<0.01),并明显改善神经元病理损伤。结论Tet(10-6mol·L-1和10-7mol·L-1)对QA所致的原代培养乳鼠海马神经元损伤有明显保护作用。     

免疫磁珠法结合条件培养基进行低密度条件下的神经元原代培养

目的利用免疫磁珠(IMB)细胞分选技术结合星形胶质细胞条件培养基(A-CM)进行低密度条件下原代神经元培养。方法取新生(24 h)内昆明小鼠取大脑半球,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液进行原代培养。培养10 d后,利用恒温振荡法去除小胶质细胞等杂细胞,抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞纯度。利用达到纯度要求的细胞培养物制备A-CM。分别取新生(24 h)内昆明小鼠大脑皮质和海马,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液,经IMB细胞分选获得高纯度神经元,加入A-CM进行低密度条件下神经元的原代培养。观察培养过程中神经元的形态学指标,以抗160 ku神经丝抗体免疫荧光染色鉴定神经元纯度。结果细胞免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞的纯度>95%。小鼠皮质和海马神经元形态学观察与细胞免疫荧光染色结果表明,神经元在低密度培养条件下生长良好,不同发育阶段的形态学特征明显,纯度较高。结论低密度条件下成功培养了小鼠大脑皮质和海马原代神经元。     

胎鼠脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 研究胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法 从孕15d胎鼠的大脑皮层和海马区脑组织中获取NSCs,在含有B27、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的DMEM/F12无血清培养液中培养;传代后用5%胎牛血清培养液诱导NSCs分化。结果 体外分离培养的NSCs在无血清培养液中形成大量的神经球。经3-5代传代的细胞生长稳定。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞,神经细胞球经胎牛血清培养液贴壁培养后可分化为神经元特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂表达阳性的细胞。结论 从孕15d胎鼠大脑皮质和海马组织分离出的NSCs具有自我更新能力和多向分化潜能,其在5%胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

新生小鼠神经干细胞体外培养、分化及鉴定

目的 简化神经干细胞原代培养的取材及步骤,明确体外定向诱导分化条件,为进一步神经干细胞移植相关实验提供基础条件。方法 新生24 h昆明种小鼠无菌条件下冰上取大脑组织,经机械分离加胰酶消化吹打后,加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和B27的DMEM/F12培养基中培养;加入不同浓度胎牛血清诱导其分化,应用免疫荧光技术行巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2染色,对培养细胞鉴定。结果 新生小鼠提取神经干细胞可形成神经球,并稳定增殖传代,经诱导可定向分化为神经元及星形胶质细胞。结论 新生小鼠较胎鼠取材简单,可培养高质量神经干细胞,血清浓度同向星型胶质细胞方向的分化概率呈正相关。     

胎鼠多巴胺能神经元前体细胞体外扩增和诱导分化的初步研究

目的　尝试体外扩增胎鼠多巴胺能神经元前体细胞并用L 抗坏血酸 2 磷酸酯倍半镁盐 (AA 2P)促其分化成多巴胺能神经元。方法　体外培养来自胎鼠中脑腹侧组织的前体细胞 ,用bFGF促其增殖 7天 ,而后用AA 2P促其分化 ,并进行免疫荧光染色分析。结果　细胞总数平均增长了 6 8倍 ,其中星形胶质细胞只占 ( 4 15± 1 37) % ,而神经元占 ( 2 0 38± 11 6 0 ) % ,多巴胺能神经元占所有神经元的 ( 2 9 4 7± 13 79) %。结论　该方法能体外扩增胎鼠多巴胺能神经元前体细胞并促其分化为多巴胺能神经元     

皮质神经元B27原代培养及MAP2鉴定

目的对原代新生鼠皮质神经元原代培养方法进行改进,以获得纯度更高、体外更易存活的神经元进行相关实验研究。方法采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮质神经元悬液,进行培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)鉴定培养神经元的纯度。结果神经元细胞存活率高,在体外培养条件下细胞状态良好,生长旺盛。培养第4天,可见多数细胞长出1、2个突起并交织成网。培养第8天细胞胞体较大,能形成典型的神经细胞网络。培养第10天,鉴定神经元纯度质量分数达90%以上。结论该方法简便可行,是体外培养神经元较理想的方法。     

NO供体硝普纳损伤脊髓背根神经元模型的建立

目的在乳鼠背根神经节神经元原代纯化培养方法的基础上,采用硝普钠(SNP)制备背根神经节神经元损伤模型。方法取乳鼠背根神经节,加入5-氟-2'-脱氧尿苷(5-FUDR)以纯化细胞,MEM-F12培养基培养,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定神经元。神经元培养至第八天分别加入不同浓度SNP(500,50,5μmol·L-1)制备背根神经节神经元损伤模型,用台盼蓝染色进行细胞计数,MTT法测定培养神经元活力。结果培养的脊髓背根神经节神经元生长状态正常,纯化培养纯度高于90%,可存活两周以上。培养的背根神经节神经元加入SNP作用后,随着浓度增加,神经元死亡率逐渐升高。结论采用SNP制备的脊髓背根神经节神经元损伤模型稳定、可靠,可以作为相关实验研究的理想的体外实验模型。     

神经干细胞提取与培养方法的比较研究

目的探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)提取、培养的最佳方法,为NSCs的基础研究提供技术参考。方法对NSCs的不同提取、培养方法进行比较:提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方法、不同传代方法,观察NSCs的成球率和NSCs未分化状态的稳定性。用多功能微孔板读数仪检测NSCs活性。结果 (1)胎龄14 d胎鼠较新生24 h内乳鼠的大脑皮质提取NSCs的比例高,杂细胞少,形成的神经球数量多。(2)采用无血清培养基,NSCs可以稳定在未分化状态;而采用含血清培养基,NSCs多数分化为神经元和胶质细胞。(3)以1.0×109·L~(-1)密度接种的NSCs,培养形成的神经球数量多,且状态良好。(4)悬浮培养法较贴壁培养法,可以形成稳定的神经球,有利于保持NSCs处于未分化的状态。(5)半量换液法和只加液不弃液法培养形成的神经球的状态优于全量换液法。(6)原代和1代的神经球用机械吹打法传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好,且较其他两种方法简便;2代及以后的神经球用Accutase酶传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好。(7)14 d胎鼠Accutase酶消化组的NSCs活性高于另外3组,差异均具有显著性(P<0.05)。结论提取胎龄14 d胎鼠的大脑皮质,采用无血清培养基,以1.0×10~9·L~(-1)1的密度接种于25 cm~2培养瓶,采取悬浮培养法,每2~3 d加液1~1.5m L,每6~7 d传代1次,所得到的NSCs增殖分裂旺盛,成球率高,神经球状态良好,可以保持稳定的未分化状态。     

新生大鼠大脑皮层神经元的原代培养

目的成功建立简便易行的原代神经元培养模型的方法。方法无菌操作条件下,培养皿或培养板经L-多聚赖氨酸包被过夜,用15%完全培养液混悬神经元,以细胞密度为5×104细胞/mL的浓度种植,24h后倒置相差显微镜观察神经元贴壁后即用阿糖胞苷(10μmol/L)以抑制神经胶质细胞及非神经细胞的增殖,每48h进行每皿或每孔半量换液。结果神经元贴壁生长较多,神经胶质或成纤维细胞被抑制,在半量换液中可清除,获得相对单纯的神经元。结论简便易行的原代皮层神经元培养方法,可以得到相对单纯体外培养的神经元模型。     

胎鼠海马神经元的无血清原代培养方法与形态学观察

目的建立SD大鼠胎鼠海马神经元的分离、培养方法，观察体外培养过程中神经元的形态学变化，为进行海马神经元的体外研究提供技术支持。方法分离18天胎龄的SD大鼠胎鼠的海马区，经机械吹打，台盼蓝计数后，采用无血清培养基接种于24孔板。每天在显微镜下进行神经元的形态观察；第7天用免疫组化染色法检测微管相关蛋白2（MAP2）的表达，进行神经元鉴定及纯度计算。结果机械分离18天胎龄的SD大鼠胎鼠海马得到细胞，经台盼蓝染色，细胞存活率在98％以上。神经元在体外生长良好，培养第7．10天时胞体最为丰满，神经元突起间互相接触形成致密的网络，28天时细胞数量明显减少，可见大量变性的神经元细胞碎片。MAP2鉴定结果显示，培养7天的海马神经元纯度为92．8％。结论此培养方法获得的海马神经元纯度高、体外存活时间长，具有简便易行，结果稳定的优点，可作为神经元体外培养的良好模型。     

腺苷A1受体转移激活表皮生长因子受体的机制研究

为探讨腺苷A1受体与表皮生长因子受体（EGFR）之间的信号作用，阐明原代培养皮层神经元上腺苷A1受体介导的神经保护机制。采用原代培养大鼠皮层神经元缺氧损伤模型、免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀、Western Blot等方法在原代培养的大鼠皮层神经元和HEK293／A1R细胞上研究腺苷A1受体与表皮生长因子受体的相互作用方式，揭示由腺苷A1受体介导的神经保护机制。     

大脑皮层神经元原代培养方法的改良及一种体外缺氧缺糖简易模型的建立

目的改进SD胎鼠大脑皮层神经元体外原代培养方法及其一种缺氧缺糖(OGD)简易模型建立。方法用温和的TrypLE胰酶消化得到单个皮层神经细胞,用含有B27的Neurobasol培养基进行培养。培养7 d后,将其培养液换成无糖DMEM培养液,放入缺氧装置中分别培养4、5及6 h,利用MTT法检测细胞存活率,并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放量。结果分离和培养的神经元生长状态良好,免疫荧光方法证明该方法培养的大脑皮层神经元纯度可达到(93.2±1.3)%,能够达到实验研究的要求。细胞OGD 4、5及6 h后,细胞存活率分别为(52.7±1.3)%、(26.5±3.3)%及(20.8±1.1)%;LDH的释放量分别为(52.9±4.8)%、(89.3±1.3)%及(93.2±1.1)%。结论改良后的培养方法能够稳定地获得高纯度的SD胎鼠大脑皮层神经元,用厌氧发生装置替代三气培养箱建立了一种OGD简易模型,同时选择OGD 4 h作为缺氧缺糖模型最佳时间点。     

银杏内酯B促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞生长发育的研究

目的探讨GB对体外培养的胚鼠脊髓神经元存活和生长发育的作用。方法胚胎大鼠脊髓神经细胞原代培养,相差显微镜下进行细胞计数和显微测量,观察GB对神经元存活和生长发育的作用。对培养7d细胞行NSE免疫组化染色,光镜下观察GB对NSE染色阳性神经元生长发育的影响。结果GB及NGF能够促进体外培养胚胎大鼠脊髓神经细胞及NSE染色阳性神经元的存活,促进其细胞及突起的生长。其促进脊髓神经细胞的存活、胞体及突起发育的作用与NGF一致,而其促进神经突起分化与生长的作用强于NGF。结论NGF和GB能促进培养大鼠发育期脊髓神经元存活、分化和生长,并且表现出各自作用的特异性。     

激活小胶质细胞α_7-nAChR减少Aβ蛋白所致的神经元毒性的研究

目的研究激活小胶质细胞上的α7-烟碱型乙酰胆碱受体对减少由于β-淀粉样蛋白1-42沉积所致的慢性炎性反应对神经元毒性作用。方法取孕18 d的胎鼠大脑皮质做原代神经元的培养,选用微管相关蛋白-2与神经元特异性烯醇化酶作为神经元特异性标志物,用免疫细胞化学技术对神经元进行鉴定。培养10 d的神经元与小胶质细胞共同培养于带有膜插件的培养皿中。试验分空白对照组、β-淀粉样蛋白组、共培养组、烟碱预处理组,各组添加β-淀粉样蛋白1-42共培养96 h后,用流式细胞仪及免疫荧光法检测神经元的凋亡率。结果体外培养10 d的神经元,用免疫荧光及DAB显色鉴定神经元均能显色,细胞纯度达到了94.49%。激活组与未激活组相比神经元的凋亡率明显下降(P<0.05)。结论激活小胶质细胞上的α7-烟碱型乙酰胆碱受体能减少β-淀粉样蛋白介导的神经元凋亡,对神经元产生保护作用。     

大鼠原代神经元的培养及操作技巧

目的:建立一种实用体外原代培养新生大鼠皮层神经元的方法.方法:取24h内的SD乳鼠两侧大脑皮层,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.利用免疫细胞化学进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长;经神经元特异性鉴定,培养的神经元纯度可达90%以上.结论:该技术是一种可靠、稳定的获得神经元的方法,可以用于实验.