灭活SARS病毒的免疫原性的实验研究

研究灭活SARS病毒的免疫原性。SARS病毒F6 9株经甲醛灭活后 ,加入氢氧化铝佐剂 ,以 3种剂量接种BALB/c小鼠 ,定时采血 ,测定特异性抗体的滴度及其中和活性 ,同时用化学发光酶联免疫法测定抗血清与SARS病毒结构蛋白的反应特异性及其相对强度。结果发现 ,小鼠接种疫苗 4d后 ,血清中可检测到IgM抗体 ,直至 2 6d后逐渐下降 ;IgG抗体在初次免疫 8d后出现 ,4 7d时达最高峰 ,6 3d后进入稳定期 ;不同剂量组的抗体滴度具有明显剂效关系 ,低剂量组和中剂量组滴度峰值为 1∶192 0 0 ,高剂量组滴度峰值为 1∶384 0 0。中和实验结果表明 ,小鼠所产生的抗体具有中和病毒活性 ,在 6 3d时 ,低剂量组和中剂量组血清的中和效价为 1∶12 80 ,高剂量组血清的中和效价为 1∶5 12 0。抗体分类结果表明 ,小鼠抗血清中含有针对多种SARS病毒结构蛋白的特异性抗体 ,其中 ,针对N蛋白、S4蛋白和S2蛋白的抗体水平相对较高 ,而抗M抗体、抗 3CL抗体的水平相对较低。上述结果说明 ,SARS病毒F6 9株经甲醛灭活后 ,各主要结构蛋白仍保持较强免疫原性 ;免疫小鼠后 ,可以诱导产生高滴度的特异性混合抗体 ,在体外可以保护敏感细胞不受SARS病毒攻击     

活体电穿孔法辅助核酸免疫制备小鼠抗棉铃虫精氨酸激酶的抗体

目的利用活体电穿孔法将携带有棉铃虫精氨酸激酶(HarmAK)基因的表达质粒导入昆明小白鼠制备抗体。方法在构建重组质粒pcDNA3-HarmAK并测序验证序列的正确性后,利用活体电穿孔辅助核酸免疫的方法将重组质粒pcDNA3-HarmAK导入到小鼠体内,免疫5次后,用ELISA检测确定抗体的效价,并对抗体的特异性进行Western blot法检测。结果小鼠抗HarmAK血清的效价达到1∶40 000,Western blot法检测的结果显示此抗血清能与融合蛋白His-HarmAK和棉铃虫总蛋白中的AK蛋白特异性结合。结论采用活体电穿孔辅助核酸免疫的方法制备了高滴度和特异性的小鼠抗HarmAK的抗体。     

β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用

目的利用人工合成β2糖蛋白1(β2GP1)多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及致病性。方法应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体,利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子(TF)mRNA和蛋白表达;Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65表达情况;体内实验采用C3H/He N小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征(EAPS)模型,检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间(APTT)。结果化学合成β2GP1多肽的纯度为94%,达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔,其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带,双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、NF-κB p65磷酸化,诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型,小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200,APTT明显缩短。结论所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子,能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。     

大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的制备大鼠Toll样受体2胞外段(TLR2ex,405T-573Q)的多克隆抗体并鉴定其活性。方法用反转录PCR从大鼠肝细胞中扩增长507个碱基的TLR2部分胞外段,并构建重组表达载体p ET28a-TLR2ex。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2ex-6×His融合蛋白,该蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。ELISA鉴定抗血清的效价,Western blot法检测抗血清的特异性。结果成功构建了原核表达载体p ET28a-TLR2ex,并成功表达纯化了TLR2ex-6×His融合蛋白,将该蛋白免疫BALB/c小鼠后获得抗血清;Western blot法结果显示该血清可以特异性地检出E3大鼠脾组织TLR2蛋白,ELISA测定该多克隆抗体的效价可以达到1∶76 800。结论成功制备了大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)的多克隆抗体。     

利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究

目的：制备转基因作物中选择标记基因——潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase，hpt)基因表达产物的多克隆抗体，并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制。方法：以hpt的cDNA全长插入真核表达载体pcDNA3中，并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定。以纯化的重组质粒pCDNA3-HPT免疫BALB／c小鼠。用在E．coli中表达并纯化的(His)6—HPT进行ELISA，检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况，并用Western blot检测抗血清的特异性。结果：经3次核酸免疫后，小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体一第4次加强免疫时，将小鼠分为3组，每组两只。第1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫，第2组用(His)6-HPT融合蛋白免疫，第3组仍用原来提取的重组质粒免疫。结果发现，第1组小鼠抗血清的效价有所上升，经ELISA检测达1：200；第2组抗血清的滴度显著升高，达到1：2000；而第3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体：Western blot证实，前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST—HPT、(His)6-HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合。结论：用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体，但抗体效价不够理想。推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水平有关，可望通过州整影响核酸免疫的其他多种因素提高抗体的水平。     

双烯雌酚人工抗原的合成及特异性抗体的制备

目的制备抗双烯雌酚(DIEN)特异性抗体,为进一步研制DIEN免疫检测试剂盒打基础。方法采用4-溴丁酸乙酯对DIEN进行活化,以活泼酯法与BSA偶联制备免疫原(DIEN-CP-BSA);经紫外扫描和飞行时间质谱扫描鉴定偶联情况;以DIEN-CP-BSA免疫Balb/c小鼠制备特异性抗体,间接(竞争)ELISA评价抗血清效价及特异性。结果本试验获得较高效价的DIEN抗血清,其效价达1∶64 000,双烯雌酚半抑制浓度(IC50)为62 ng/ml;抗血清与结构类似物己烷雌酚的交叉反应率仅为0.34%,与己烯雌酚和17-β雌二醇无交叉反应;利用该抗体建立的间接竞争ELISA检测法,双烯雌酚在10～300 ng/ml呈线性关系。结论本研究制备了抗双烯雌酚(DIEN)特异性抗体,为研究畜产品中DIEN残留及开发DIEN免疫检测试剂盒奠定了基础。     

汉滩病毒G2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体制备及鉴定

目的制备抗疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体,鉴定其与组织抗原MDIi的反应性。方法以PCR扩增获得MDIi序列构建原核表达载体pET-32a/MDIi,转化大肠杆菌进行表达;对表达产物鉴定后,免疫小鼠制备抗MDIi多克隆抗体;间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体与疣鼻栖鸭组织MDIi的反应强度。结果成功构建了pET-32a/MDIi原核表达载体,诱导表达了相对分子质量(Mr)约40 000的包涵体形式的MDIi重组蛋白,免疫小鼠获得效价为1∶128 000的特异性多克隆抗体,抗体与疣鼻栖鸭组织中的MDIi反应滴度为1∶32 000。结论成功制备了高效价的特异性抗MDIi多克隆抗体,抗体与组织抗原有较强的免疫反应性。     

大鼠透明质酸合成酶-2抗血清的制备及鉴定

目的: 制备大鼠透明质酸合成酶-2(HAS-2)抗血清并鉴定抗血清灵敏度及其特异性.方法: 通过生物信息学分析选取HAS-2非保守的亲水区域作为抗原, 通过原核表达纯化后免疫家兔, 制备出抗血清.Western blot检测所制备抗血清的灵敏度.真核瞬时表达大鼠HAS-2和HAS-3, 分别用抗His抗体和抗血清检测, 鉴定制备抗血清的特异性.结果: 通过原核表达并纯化得到抗原多肽, 免疫家兔后获得ELISA效价大于1∶ 10 000的抗血清.所制备的抗血清至少可以检测出10 ng以上的抗原多肽, 并且能够特异地检测HAS-2而与HAS-3无反应.结论: 成功通过大鼠HAS-2非保守区域多肽的原核表达产物制备出高灵敏度和特异性的大鼠HAS-2抗血清, 为研究透明质酸(HA)的病理生理意义提供了有利支持.     

藤黄微球菌Rpf结构域多肽诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的:研究藤黄微球菌Rpf结构域多肽的免疫学特性.方法:用原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫哌BALB/c小鼠3次,每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增值指数.ELISA方法检测淋巴淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10和IL-12产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果:藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶128 000,淋巴细胞增殖指数为(2.10±0.12),明显高于生理盐水对照组(0.90±0.21).ELISA方法检测Rpf结构域多肽免疫组IFN-γ,IL-10和IL-12水平为(1 126±36) ng/L,(368±13)ng/L和(289±14)ng/L,明显高于生理盐水对照组(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rpf结构域多肽免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有明显作用(细菌负荷为5.03±0.11,P<0.05).结论:藤黄微球菌Rpf结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

茵陈蒿汤对免疫小鼠ABO血型抗体产生的抑制作用研究

目的:研究茵陈蒿汤对ABO血型抗体分泌细胞的抑制作用。方法:以人A型红细胞免疫BALB/c小鼠,通过间接抗人球蛋白试验,吸收放散试验和IgG型抗-A效价的检测等观察A型红细胞免疫组和茵陈蒿汤治疗组中BALB/c小鼠体内IgG型抗-A抗体的水平变化。结果:对照组BALB/c小鼠均未捡测出IgG型抗-A抗体,免疫组BALB/c小鼠均产生IgG型抗-A抗体,茵陈蒿汤治疗组中有5只没有检测到IgG型抗-A抗体,11只BALB/c小鼠产生了IgG型抗-A抗体。间接抗人球蛋白试验,吸收放散试验和IgG型抗-A效价的检测结果显示免疫组和茵陈蒿汤治疗组IgG型抗-A水平均高于对照组(P<0.05),茵陈蒿汤治疗组抗-A水平低于免疫组(P<0.05),茵陈蒿汤治疗组抗-A效价与对照组比较无差异(P>0.05)。结论:小鼠动物试验证实茵陈蒿汤可抑制ABO血型抗体的分泌。     

中国株HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫小鼠免疫应答的实验研究

目的 :构建中国流行株HIV 1外膜蛋白 (gp12 0 )基因疫苗并接种小鼠 ,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法 :将HIV 1gp12 0基因插入到真核表达载体pVAX1中 ,构建重组真核表达质粒pVAX1 GP12 0 ,并经EcoRI和PstI双酶切以及测序鉴定。同时以pVAX1 GP12 0和空载体pVAX1分别免疫BALB/c小鼠 ,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN γ水平 ,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖 ,用乳酸脱氢酶 (LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的应答。结果 :酶切及测序结果表明 ,成功地构建了HIV 1gp12 0基因疫苗。与空载体pVAX1组相比较 ,pVAX1 GP12 0免疫组小鼠血清抗HIV 1gp12 0抗体的滴度和IFN γ的水平均升高 ,两者差异显著 (P <0 .0 1)。pVAX1 GP12 0免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数 (SI)及特异性CTL的杀伤活性 ,均高于空载体pVAX1组 (P <0 .0 1)。结论 :构建了针对我国HIV 1流行株的gp12 0基因疫苗。以其免疫BALB/c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答 ,为进一步将其用于我国的HIV的治疗奠定了基础。     

疟疾DNA疫苗免疫接种方法对小鼠 体液免疫应答的影响

目的 探讨DNA疫苗免疫接种方法对抗体水平及辅助性T细胞极化的影响。方法 利用DNA重组技术构建恶性疟原虫红内期多表位DNA疫苗,通过基因枪、肌肉注射、皮内注射等接种方法免疫小鼠,经ELISA测定该疫苗诱导产生特异性抗体的总量、亚型及表位特异性,比较不同免疫接种方法对DNA疫苗诱导产生抗体及辅助性T细胞极化的影响。结果 接种DNA疫苗的小鼠经3次免疫后都产生了较高滴度的抗重组蛋白抗体。基因枪组单位DNA诱导抗体滴度是肌注组的120倍。基因枪组小鼠血清抗体以IgG1升高为主,而肌注和皮内注射组小鼠血清抗体均以IgG2a升高为主。各免疫接种组诱导产生的抗表位多肽抗体特异性相同。结论 不同免疫接种方法不但会影响血清总免疫球蛋白水平,还能使辅助性T细胞向不同方向极化。肌注和皮内注射诱导产生以IgG2a为主的TH1型免疫应答,基因枪接种诱导产生以IgG1为主的TH2型免疫应答。DN疫苗的摄取方式可明显影响辅助性T细胞的极化。     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.     

HIV DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫效果的研究

目的 构建含HIV-1B亚型中国株gagV3基因的DNA疫苗及重组腺病毒伴随病毒(rAAV)疫苗，并研究DNA疫苗和rAAV联合免疫的免疫效果。方法 将HIV-1B亚型中国株gagV3基因克隆入真核表达载体pCI-neo上，构建了含HIV-1 gagV3基因的DNA疫苗pCI-gagV3。采用电击法将pCI-gagV3质粒转染p815细胞，用G418压力筛选，得到转入重组质粒的细胞系p815-gagV3，用免疫酶法检测细胞系中HIV-1基因的表达。用该DNA疫苗进行小鼠免疫实验，检测免疫效果；用该DNA疫苗初次免疫，含同样gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒rAAV-gagV3加强免疫，采用免疫酶法检测免疫小鼠血清中HIV-1特异性的抗体水平，用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的HIV-1特异性CTL水平。结果 pCI-gagV3可以在p815细胞中表达HIV-1的基因，免疫BALB／c小鼠后可以在小鼠体内诱发HIV-1特异性的细胞和体液免疫反应。HIV-1特异性抗体滴度为1：20；效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为41．7％。pCI-gagV3与rAAV-gagV3联合免疫并不能明显提高抗体水平，但可以提高CTL反应，效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为61.3％，高于单独用DNA疫苗或重组AAV疫苗免疫后产生的CTL活性。结论 DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫可以提高免疫小鼠产生的HIV-1特异性CTL反应。     

马传染性贫血病毒囊膜蛋白GP90的表达及其免疫效果研究

目的：探索马传染性贫血病毒（EIAV）野毒株（强毒，LN）和疫苗毒株（弱毒，DLV）的囊膜蛋白GP90作为鉴别诊断试剂的效果及基因工程疫苗的可能性。方法：将中国EIAV疫苗株（DLV）及其亲本毒株辽毒株（LN）接种于驴外周血白细胞培养物，提取前病毒DNA，并以其为模板，经聚合酶链法（PCR）扩增出LN和DLV的GP90片段，在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达。表达的GP90蛋白经金属离子亲和层析（IMAC）纯化后免疫小鼠，ELISA法检测抗EIAV抗体，中和试验检测中和抗体活性。同时对DLV和LN GP90的核苷酸与氨基酸进行比较。结果：DLV和LN GP90核苷酸序列的同源性为95．3％，氨基酸序列的同源性为87.7％。未加佐剂组抗体滴度为800，佐剂组抗体滴度达1600;不加佐剂组的中和抗体滴度在40－80之间，加佐剂组中和抗体滴度在80－160之间。结论：成功构建了分别表达EIAV野毒株LN和疫苗毒株DLV囊膜蛋白GP90的重组杆状病毒，大量表达的蛋白纯化后纯度较好，该纯化产物在小鼠体内可激发良好的体液免疫应答。     

小鼠对HIV-2 gp105核酸疫苗免疫应答的研究

目的: 探讨HIV- 2gp105基因核酸疫苗在小鼠体内的免疫应答, 为开发HIV- 2核酸疫苗提供实验依据。方法:将HIV- 2外膜蛋白 (gp105 )基因插入真核表达质粒载体pVAX1中, 构建pVAX1 gp105重组表达质粒。将其肌注免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法检测小鼠血清抗HIV -2抗体, 用流式细胞仪测定CD4 、CD8 T细胞亚群数, 以乳酸脱氢霉释放法检测脾特异性CTL的杀伤活性。结果: 重组质粒pVAX1 -gp105免疫组小鼠的血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量及特异性CTL的杀伤活性, 均明显高于对照组, 分别为P<0. 01, P<0. 05和P<0. 01。结论: HIV -2gp105核酸疫苗能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫。     

Anti-morphine antibody contributes to the development of morphine tolerance in rats

Previous studies have shown that tolerance to the antinociceptive effect of morphine develops after a prolonged exposure, but its mechanisms remain unclear. In the present study, we examined whether anti-morphine antibody produced by chronic morphine exposure would contribute to the development of morphine antinociceptive tolerance in rats. Our results showed that anti-morphine antibody was present in rats rendered tolerance to antinociception after intrathecal morphine exposure for seven consecutive days. Superfusion of anti-morphine antibody onto spinal cord slice dose-dependently produced an inward excitatory current in spinal cord dorsal horn neurons using whole-cell patch-clamp recording, which surpassed morphine-induced outward inhibiting current. Co-administration of morphine with a monoclonal antibody (2.4G₂) against Fc receptors for seven days significantly attenuated the production of anti-morphine antibody as well as the behavioral manifestation of morphine tolerance in same rats. These results indicate that anti-morphine antibody produced by morphine exposure may contribute to the development of morphine tolerance possibly through counteracting the inhibitory morphine effect on spinal cord dorsal horn neurons.