巨细胞病毒感染对调节性T细胞和Ⅰ型、Ⅱ型辅助性T细胞分化增殖的影响

目的定量检测巨细胞病毒（murine cytomegalovirus,MCMV）感染小鼠脾细胞调节性T细胞（Treg）、辅助性T细胞1型和2型（Th1/Th2）特异性转录因子Foxp3、T-bet和GATA-3mRNA水平的动态变化,探讨MCMV在急慢性感染期对Treg、Th1和Th2细胞分化增殖的影响及其意义。方法建立MCMV全身播散型感染模型,根据主要脏器内病毒滴度,确定感染后28d为本模型急、慢性期界定点。42只模型鼠分别于接种病毒后第1、3、7、14、28、45、60天各处死6只小鼠,分离脾细胞,以灭活MCMV抗原为刺激原,体外培养5d,另设42只正常小鼠作为模拟感染对照。用Real-timeRT-PCR法检测小鼠脾细胞Foxp3、T-bet和GATA-3mRNA表达强度。结果MCMV感染组第7天T-betmRNA表达显著增高达峰值,与模拟感染对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,随后下降,到第28天降到对照组相当水平,至第60天显著低于对照组（P〈0.01）;而GATA-3mRNA在感染后第3天表达开始升高,第7天达峰值,第14天开始缓慢下降,但至第60天仍显著高于对照组（P〈0.05）;Foxp3mRNA表达在感染后14天明显低于对照组,第28天显著降低（P〈0.01）,但至第45天开始明显上调,第60天升高更显著（P〈0.01）。结论在感染急性期,Treg未被诱导活化,宿主产生有效Th1/Th2应答反应,但随后逐渐下降,并向Th2偏移;在感染慢性期,Treg细胞增殖活化显著,进一步抑制Th1和Th2反应,且对Th1抑制效应更强,提示CMV诱导Treg细胞增殖活化是其抑制宿主抗病毒免疫而呈持续慢性感染的重要原因。     

小鼠巨细胞病毒全身播散型感染模型的建立

目的 用小鼠巨细胞病毒(MCMV)Smith株建立BALB/c小鼠全身播散型感染模型.方法 15只BALB/c小鼠随机分为3组,于腹腔内接种0.2 ml不同浓度小鼠巨细胞病毒悬液(分别为5×104、5×103,5×103PFU);另5只设为正常对照组.各组分别于接种7 d后处死小鼠,取小鼠唾液腺分离病毒并观察小鼠主要脏器组织病理损害.结果 从接种MCMV 5×103 PFU组小鼠唾液腺分离出小鼠巨细胞病毒,小鼠肝、肺、肾和心脏组织病理损害明显.结论 建立小鼠巨细胞病毒全身播散型感染模型,可为抗巨细胞病毒药物筛选、疗效评估和疾病发病机制和疾病预后评估提供一个良好动物模型.     

巨细胞病毒感染对Th1/Th2细胞分化特异性转录因子T-bet/GATA-3表达的影响

目的动态观测小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对小鼠Th1/Th2细胞特异性转录因子T_bet/GATA_3表达的影响。方法建立MCMV感染模型,20只模型鼠分别于接种MCMVSmith株后第3、5、7、14天各处死5只;另设20只正常小鼠作为对照。用蚀斑形成法测定脾组织病毒滴度;双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清Th1类细胞因子IFN_γ和Th2类细胞因子IL_10表达水平;Western_blot法检测脾组织转录因子T_bet/GATA_3表达强度。结果MCMV感染早期IFN_γ表达显著上升,在感染第3天达峰值,与正常对照组比较差异显著(P<0.01);随后迅速下降,在感染第14天左右基本降至基线水平。T_bet转录因子表达在感染3d后逐渐下降,第7～14天表达显著低于感染后第3天(P<0.01)。IL_10表达在MCMV感染第5天增高,随后下降;在感染第14天又升高,与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)。转录因子GATA_3表达水平在MCMV感染第7～14天显著高于感染后第3天(P<0.01)。小鼠脾组织病毒滴度在感染第5天出现第1次高峰,随后下降,在感染第14天又增高达到峰值。结论MCMV感染通过上调GATA_3转录因子和IL_10表达,下调T_bet转录因子和IFN_γ表达,导致Th1/Th2失衡,表现为Th2细胞优势应答状态,这可能是CMV感染致宿主特异性细胞免疫功能降低并逃避机体特异性细胞免疫攻击的原因之一。     

一氧化氮抗小鼠巨细胞病毒的实验研究

目的 探讨一氧化氮（NO）在小鼠巨细胞病毒（MCMV）感染模型中的作用。方法 应用34只6－8周龄雌性BALB／C小鼠按所给药物不同分5组,观察每组小鼠血清中一氧化氮代谢产物亚硝酸盐的含量及肝组织中iNOS mRNA的表达和MCMV的感染量。（1）应用亚硝酸盐还原法检测小鼠血清中NO代谢产物亚硝酸盐的含量;（2）应用原位核酸分子杂交法检测模型鼠的肝组织中iNOSmRNA的表达。（3）应用β－半乳糖苷酶（β-gal）染色法和原位核酸分子杂交技术检测模型鼠肝组织中的MCMV的感染量。结果 MCMV感染小鼠各组（A、B、C）血清中丙氨酸转氨酶（sALT）及NO代谢产物亚硝酸盐NO2的含量均较正常对照组（D）及仅给NO合成抑制剂的对照组（E）明显升高,且相应受到NO合成抑制剂及促进剂的影响。而正常对照组（D）与仅给NO合成抑制剂的对照组（E）间则无明显差异。还可看到MCMV感染各组（A、B、C）小鼠肝细胞中表达iNOS mRNA,同时MCMV IEgene检测阳性,而无MCMV感染的小鼠（D和E组）肝细胞中则无iNOS mRNA表达,MCMV IE gene检测亦是阴性。同时可见给NO合成抑制剂L－NAME的B组小鼠血清中NO2浓度及肝组织切片中iNOS mRNA表达水平较MCMV感染模型小鼠A组降低,而与之相对应,其肝组织中β-gal阳性率及MCMV IE gene的表达却较A组增高（P＜0．05）。而给了NO合成促进剂L－Arg的C组的小鼠的结果却与上述相反,即血清中NO2浓度和肝组织切片中iNOS mRNA表达水平越高,则肝组织中MCMV感染量就越低。结论 本研究结果说明NO在MCMV感染小鼠体内具有抗MCMV的作用。     

含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸2395对鼠巨细胞病毒肝炎新生小鼠的治疗作用北大核心CSCD

目的 研究含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸2395（CpG ODN2395）对鼠巨细胞病毒（MCMV）肝炎新生小鼠的治疗作用及相关机制.方法 SPF级BALB/c新生小鼠,按窝随机分为对照组、病毒组和治疗组.对照组：腹腔注射9 g/L盐水20×10-6L隔日1次;病毒组：腹腔注射MCMV（病毒致半数细胞感染量TCID50=108.31/L）20×10-6L1次,从接种MCMV当日起隔日腹腔注射9 g/L盐水20×10-6L;CpG治疗组：腹腔注射MCMV（TCID50=108.31/L） 20×10-6L1次,从接种MCMV当日起隔日腹腔注射CpG ODN2395 20 mg/kg.观测小鼠的生长发育情况.HE染色观察肝脏病理,酶联免疫吸附试验检测小鼠血清ALT、IFN-α,PCR法检测肝脏MCMV DNA,反转录（RT）-PCR法检测肝脏IFN-α mRNA,Wester blot法检测肝脏的Toll样受体9（TLR9）和衔接蛋白-髓样分化标志物88 （MyD88）的表达水平.应用SPSS 16.0软件进行分析.结果 1.病毒组小鼠生长发育落后,体质量低于对照组和治疗组,7d、14 d时差异有统计学意义（F=18.919、25.543,P均＜0.05）;治疗组发育介于对照组和病毒组之间,体质量均低于对照组,在7d时差异有统计学意义（t=3.187,P ＜0.05）.2.病毒组小鼠血清ALT高于对照组和治疗组,治疗组血清ALT高于对照组,差异均有统计学意义（F=11.407、11.791、154.565,P均＜0.05）.3.肝组织病理改变：病毒组肝组织病变活动性积分（HAI）值在第3天达高峰,以后逐渐下降;治疗组肝组织HAI均值也在第3天达高峰,但肝损害明显轻于病毒组,以后肝病变逐渐减轻,在第7天和第14天时HAI均值都显著低于病毒组.4.病毒组和治疗组小鼠3d、7d和14 d时肝脏MCMV DNAPCR检测阳性,3个时间点治疗组MCMV DNA负荷量均低于病毒组.5.病毒组和治疗组的3d时血清IFN-α达高峰,7d、14 d时渐下降;治疗组的血清IFN-α高于病毒组和对照组.6.病毒组和治疗组肝脏IFN-α mRNA表达水平在3d时增加,7d时达高峰,14 d时下降,3个时间点表达水平差异有统计学意义.治疗组IFN-αmRNA表达水平高于病毒组和对照组,病毒组高于对照组.7.治疗组肝脏TLR9表达水平高于病毒组和对照组,病毒组高于对照组.治疗组肝脏MyD88表达水平高于病毒组和对照组,病毒组高于对照组.结论 CpGODN2395可能提高TLR9的表达水平,通过MyD88依赖途径激活IFN-α的分泌,抑制MCMV的复制,减轻新生小鼠MCMV肝炎肝功能损害,改善肝脏病变和降低肝脏病毒负荷量具有抗MCMV的活性作用.     

小鼠巨细胞病毒感染对调节性T细胞扩增的影响及机制

目的 在体内外水平研究小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对调节性T细胞(Treg)扩增的影响及其可能的机制.方法 建立全身播散型MCMV慢性感染模型,分别采用Western blot法和流式细胞术动态检测小鼠脾细胞中Foxp3的蛋白表达强度和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比率;模拟MCMV感染细胞的免疫环境,建立T淋巴细胞与MCMV感染的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)共培养细胞模型,在培养前和共培养3 d后检测T淋巴细胞中的Foxp3蛋白表达水平及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比率,RT-PCR方法检测MEF中转化生长因子(TGF)-βmRNA表达水平,双抗体夹心ELISA方法检测共培养上清中TGF-B蛋白表达水平.结果 整体研究发现,MCMV在感染慢性期可显著增加T淋巴细胞中Foxp3的蛋白表达水平和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比率.体外细胞模型发现,MCMV感染在体外同样可以上调T细胞中的Foxp3蛋白表达和Treg细胞比率.TGF-β在MEF中的基因表达和上清中的蛋白表达在MCMV感染后显著增加.结论 MCMV感染在体内外均可诱导Treg在数量上的扩增和功能上的活化;MCMV感染导致宿主细胞TGF-β表达水平升高,可能是其在外周诱导Treg种群扩增的重要机制之一.     

新生小鼠巨细胞病毒肝炎模型的建立

目的 探讨建立鼠巨细胞病毒(MCMV)感染致新生小鼠肝炎模型的可行性.方法 48只日龄24 h内新生BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组每只小鼠腹腔注射MCMVSmith株20μl TCID50(104.31/0.1 ml),对照组注射无菌生理盐水20μl,注射第3、7、14天取血清和肝脏,检测血清ALT水平,肝脏组织HE染色后用光镜检查组织病理损害,同时提取肝脏组织的DNA,应用MCMV及β-actin引物行PCR扩增,然后跑电泳和测序.结果 实验组小鼠ALT水平(U/L)在3天时即明显升高,7天达高峰,14天时有所下降,与对照组比较,差异均有统计学意义[3天:(58.7±11.5)比(25.0±10.6),7天:(169.6±57.4)比(25.1±8.4),14天:(157.3±15.5)比(26.5±9.4),P均＜0.01].实验组小鼠肝组织内均可见肝细胞气球样变性,点灶状坏死,门管区炎性细胞浸润,肝细胞核内病毒包涵体,7天时最严重;对照组肝细胞无相似病理变化.实验组MCMV-DNA PCR电泳全部出现阳性条带,阳性条带测序结果与MCMV基因序列的同源性完全相符.结论 MCMV能侵袭BALB/c新生小鼠引起肝炎,这种模拟人类巨细胞病毒肝炎的新生小鼠模型的建立为该病动物实验研究提供了可能.     

调节性T细胞在小鼠巨细胞病毒感染胚胎成纤维细胞机制中的免疫调控作用

目的 体外研究调节性T细胞（Treg）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）感染小鼠巨细胞病毒（MCMV）机制中的免疫调节作用。方法 采用尼龙毛柱和MACS Treg磁珠法获得纯化的Treg和去除Treg的T细胞（TdepTreg），建立TdepTreg和添加Treg的T细胞与感染MCMV的MEF（MEFMCMV）体外共培养细胞模型。用蚀斑法检测共培养细胞上清中感染性病毒量；流式细胞术检测共培养体系中Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)，Tc2（CD3+CD8+IL4+），Th1（CD3+CD8-IFN-γ+），Th2（CD3+CD8-IL-4+）细胞比率变化；双抗体夹心ELISA法检测共培养细胞上清中转化生长因子-β（TGF-β）和IL-10蛋白表达水平。结果 TdepTreg与MEFMCMV共培养3 d后上清中感染性病毒量较感染对照组显著降低，同时效应性T细胞各亚群比率较非感染对照组显著增加。向TdepTreg-MEFMCMV体系中添加Treg可增加共培养体系中感染性病毒量，同时Tc1、Tc2和Th1细胞比率显著减少，且均与Treg比率存在剂量相关性；而Th2比率仅在Treg比率增至20%时显著低于感染对照组。添加Treg的共培养体系中IL-10和TGF-β蛋白表达水平随Treg比率增加而增高，与Treg存在正性相关。结论 Treg可通过IL-10、TGF-β等途径抑制效应性T细胞的免疫保护作用，并且由于Treg抑制作用的不均衡性，导致Th1/Th2和Tc1/Tc2平衡失调，创造了一个利于CMV增殖的免疫环境。     

用重组病毒株建立鼠巨细胞病毒性肝炎的实验模型

用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠巨细胞病毒 (murinecytomegalovirus ,mCMV)性肝炎模型。20只BALB/c甲基强的松龙免疫抑制小鼠 ,腹腔接种1×106PFU病毒悬液 ,动态观察血单个核细胞和组织中mCMV感染及肝组织病理变化。结果 :①mCMV感染小鼠血单个核细胞中X -gal染色阳性细胞在48h时开始出现 ,第3天有所减少 ,在第6天达到高峰;②肝、肺、肾组织病毒感染72h后可见 ,在第12天斑点数最多 ,以肝组织病毒感染多见;③肝组织病变在病毒感染后96h开始出现 ,在第12天达到高峰。提示 :利用重组mCMV建立的mCMV性肝炎小鼠模型 ,在感染后2周仍保持较高感染水平 ,为CMV的研究提供了一个良好的实验模型。     

卵蛋白致敏小鼠对呼吸道合胞病毒感染的免疫应答

目的探讨卵蛋白（OVA）致敏小鼠感染呼吸道合胞病毒（RSV）后肺内炎症及T辅助细胞相关细胞因子变化的特点。方法将Balb／c小鼠随机分成正常未致敏和致敏（用OVA雾化吸入）2个系列。每个系列中又包括对照组、RSV感染组。以肺组织病理检测和IL-4、IFN-γ mRNA表达作为评价指标。结果病理检查证实小鼠感染RSV后发展为典型的间质性肺炎；致敏小鼠感染RSV后病变更明显，细支气管周围淋巴细胞浸润形成管套增厚，嗜酸细胞增多，炎性细胞浸润的细支气管比例显著增高。单纯RSV感染小鼠肺组织IFN-γ mRNA有显著表达，但无IL-4 mRNA表达；致敏小鼠感染RSV后IL-4 mRNA的表达显著，但IFN-γ mRNA几乎不表达。结论致敏小鼠感染RSV后肺组织病变较单纯RSV感染者严重；单纯RSV感染后小鼠肺组织T辅助细胞因子改变呈Th1反应，而致敏后再感染RSV后则呈Th2反应。