血卟啉甲醚声动力诱导体外C6胶质瘤细胞凋亡与蛋白Bcl-2/Bax表达

目的 探讨血卟啉甲醚声动力疗法(sonodynamic theraoy,SDT)对体外C6胶质瘤细胞的促凋亡作用及蛋白Bcl-2/Bax表达.方法 取处于对数生长期C6胶质瘤细胞接种于96孔6孔培养板上.采用噻唑蓝比色分析法(MTT)观察不同时间超声辐照后细胞存活率,筛选最佳照射时间;流式细胞仪检测24 h后对照组(control)、血卟啉甲醚组(hematoporphyrin monomethyl ether ,HMME)、单纯超声组(ultrasound)、超声联合HMME组(SDT)C6胶质瘤细胞凋亡率;Western blot 检测凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达.结果 当超声频率为1.0 MHz,声强为1.0 W/cm2 ,MTT筛选60s为最佳辐照时间.同对照组、HMME及单纯超声组比较,SDT组凋亡率明显增高(P<0. 05),同时伴有凋亡蛋白Bax,上调表达,Bcl-2下调表达.结论 血卟啉甲醚声动力诱导体外C6胶质瘤细胞凋亡,Bcl-2/Bax参与并调节凋亡过程.     

超声辐照对大鼠颈总动脉损伤后细胞凋亡的影响

目的　观察不同频率 ,不同声强的超声辐照对大鼠颈总动脉球囊过扩张后平滑肌细胞凋亡的影响 ,为超声防止再狭窄筛选适宜的治疗参数。方法　 3 5只雄性Wistar大鼠 ,体重 ( 3 5 0± 5 0 )g ,随机分为 7组 ,对照组用 2F球囊导管对大鼠颈总动脉进行过扩张 ;治疗组为球囊扩张 +超声辐照 ,在球囊扩张后分别用频率为 70 5kHz ,2 .17MHz ,5 .48MHz ,强度为 1W cm2 ,2W cm2 (共 6组 )的连续型超声波对损伤血管局部进行 3min照射。喂养 2周后取材 ,TUNEL标记法检测凋亡细胞百分率的改变 ,以观察超声辐照对血管平滑肌细胞凋亡的影响。结果　球囊损伤 2周后治疗组TUNEL阳性细胞率分别有不同程度的升高 ,与对照组比较 70 5kHz ,1W cm2 升高明显 [( 3 0 .2± 3 .8) %vs( 18.6± 2 .4) % ,P <0 .0 5 ) ] ,有显著差异 ,而其它 5组的TUNEL阳性细胞率有不同程度的升高 ,但与对照组比较 ,经统计学分析无差异显著(P >0 .0 5 )。结论　一定剂量的超声辐照能诱导大鼠颈总动脉损伤后血管平滑肌细胞凋亡。在本实验设置的参数中 ,70 5kHz、1W cm2 超声辐照能增加平滑肌细胞凋亡 ,一定程度上减轻了其狭窄程度     

聚焦超声对慢性湿疹模型豚鼠皮肤淋巴细胞和角质形成细胞凋亡的影响

目的探讨聚焦超声诱导慢性湿疹模型豚鼠皮肤淋巴细胞和角质形成细胞凋亡的作用及其机制。方法健康豚鼠40只,每只背部剃毛2处,应用2,4-二硝基氯苯为抗原,小剂量多次刺激豚鼠皮肤制备慢性湿疹模型。将模型随机分为1W组和2W组,自身空白对照。辐照后在24、48h采用TUNEL法和免疫组化法观察2W组、1W组和对照组细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果辐照组的皮肤淋巴细胞和角质形成细胞凋亡率和Bax蛋白表达高于对照组,2W组高于1W组,48h高于24h。辐照组Bcl-2蛋白表达低于对照组。Bcl-2蛋白表达与凋亡细胞率呈负相关,Bax与凋亡细胞率呈正相关。结论聚焦超声辐照豚鼠慢性湿疹模型可明显提高Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,进而促进慢性湿疹动物模型皮肤淋巴细胞和角质形成细胞的凋亡。     

超声联合微泡诱导血管平滑肌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨低频超声联合脂质微泡诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的可能机制.方法 以低频连续波超声(频率1 MHz、声强0.3 W/cm2)联合脂质微泡(1 μl/ml)辐照VSMCs 120 s.分别用流式细胞仪Annexin V/PI染色、免疫细胞化学技术、荧光探针Fura-4/Am负载后激光共聚焦法检测细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达和细胞内游离Ca2 浓度的变化情况.结果 与对照组和血小板衍生生长因子-BB刺激组(PDGF)比较,两组超声辐照联合微泡[(US MB)组和(PDGF US MB)组]的VSMCs凋亡率显著增加、Bax蛋白表达明显上调、而Bcl-2蛋白表达则显著减少(P<0.01);而且PDGF US MB组的细胞凋亡率明显高于US MB组,Bax蛋白表达上调和Bcl-2蛋白表达下调的程度较US MB组更为显著(P<0.01).各实验干预组VSMCs内Ca2 浓度均较对照组显著增高(P<0.01);PDGF US MB组和US MB组细胞内Ca2 浓度均明显低于PDGF组(P<0.01).结论 超声联合微泡诱导VSMCs凋亡的机制可能与细胞内游离Ca2 浓度增加、Bax蛋白表达增加和Bcl-2蛋白表达降低有关.     

低频超声辐照联合微泡对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察低频超声辐照联合微泡对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法联合不同浓度的SonoVue(0、0.5×106、1.0×106、1.5×106、2.0×106/mL),使用42.6kHz超声分别辐照大鼠主动脉平滑肌细胞10s、20s、30s,空白对照组不作任何处理。台盼蓝染色分析辐照后即刻细胞存活率,流氏细胞仪观察辐照后24h细胞凋亡率。结果细胞的死亡和凋亡与微泡浓度及辐照时间相关。当超声波在微泡浓度达到或超过0.5×106/mL,联合辐照30s,以及微泡浓度达到2.0×106/mL,联合辐照10s、20s时,细胞大量死亡。在超声辐照10s时,辐照后24h细胞凋亡率随微泡浓度的增加而增加,但在微泡浓度低于1.0×106/mL时,细胞即刻存活率并无显著减少。在超声辐照20s时,细胞即刻存活率随微泡浓度的增加而减少,辐照后24h细胞凋亡率在微泡浓度为0.5×106/mL、1.0×106/mL、1.5×106/mL时差异无统计学意义。结论在一定空化强度范围内,低频超声辐照后24h细胞凋亡率随强度增加而增加,但超过一定程度,则无法增加细胞凋亡率,只会导致细胞死亡。低频超声辐照联合微泡的空化作用可在短时间内诱导体外培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。     

血管平滑肌细胞凋亡与阿托伐他汀的干预效应

目的:观察阿托伐他汀对血管平滑肌细胞凋亡的影响,并探讨凋亡抑制因子Survivin蛋白表达的意义。方法:实验于2004-04/2005-03在医学遗传学国家重点实验室中南大学湘雅二医院中心实验室完成。①取培养五六代的5只1月龄健康雄性大鼠主动脉中层平滑肌细胞,进行干预前于六孔培养板中放置无菌盖玻片,细胞长满盖玻片的90%时开始干预,分为4组进行干预:正常对照组:培养的平滑肌细胞未用阿托伐他汀干预;阿托伐他汀0.1μmol/L组:用浓度为0.1μmol/L的阿托伐他汀干预培养的平滑肌细胞;阿托伐他汀1.0μmol/L组:用浓度为1.0μmol/L的阿托伐他汀干预培养的平滑肌细胞;阿托伐他汀10.0μmol/L组:用浓度为10.0μmol/L的阿托伐他汀干预培养的平滑肌细胞。②分别于干预后6,12,24,48,72h采用Hoechst33258荧光染色观察血管平滑肌细胞凋亡情况;用免疫组化法检测血管平滑肌细胞凋亡抑制因子Survivin蛋白表达情况。③组间差异比较采用t检验。结果:①荧光染色检测血管平滑肌细胞凋亡结果显示,阿托伐他汀干预培养的大鼠血管平平滑肌细胞后,随干预时间延长和用药浓度增加,平滑肌细胞凋亡增加。阿托伐他汀干预72h后,血管平滑肌细胞凋亡率:阿托伐他汀0.1,1.0,10.0μmol/L组明显高于正常对照组(11.1%,27.2%,50.5%,3.8%,P<0.01),各组间两两比较差异明显(P<0.01)。②培养的血管平滑肌细胞Survivin因子表达情况:阿托伐他汀干预24h,血管平滑肌细胞凋亡抑制因子Survivin蛋白表达下降,干预48h～72h,血管平滑肌细胞Survivin因子未见表达。结论:①阿托伐他汀可诱导血管平滑肌细胞凋亡,其凋亡率呈时间和剂量依赖性。②阿托伐他汀致血管平滑肌细胞凋亡的作用可能与其下调凋亡抑制因子Survivin蛋白的表达有关。     

超声联合微泡对不同细胞周期血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨超声联合微泡对不同细胞周期血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响.方法 组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用血清饥饿法和胸苷双阻断法使细胞同步化, 并用流式细胞仪分析同步化结果.以频率1 MHz、声强0.3 W/cm2的连续波超声联合脂质微泡辐照不同细胞周期的VSMCs 120 s,分别用噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪AnnexinV/PI染色、免疫细胞化学技术检测VSMCs的增殖、凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)表达.结果 成功获得同步化的G0/G1期和S期VSMCs,其同步化率分别为89.53%和66.87%.超声联合微泡可显著抑制S期细胞的增殖并下调PCNA蛋白表达,对G0/G1期细胞的增殖和PCNA表达无明显影响;G0/G1期和S期细胞的凋亡率均较辐照前增高,且对于S期细胞超声联合微泡诱导凋亡的作用更为显著.结论 超声联合微泡对处于增殖状态的VSMCs具有显著的抑制增殖和诱导凋亡的作用.     

血管平滑肌细胞凋亡与阿托伐他汀的干预效应

目的：观察阿托伐他汀对血管平滑肌细胞凋亡的影响,并探讨凋亡抑制因子Survivin蛋白表达的意义.方法：实验于2004-04/2005-03在医学遗传学国家重点实验室中南大学湘雅二医院中心实验室完成.①取培养五六代的5只1月龄健康雄性大鼠主动脉中层平滑肌细胞,进行干预前于六孔培养板中放置无菌盖玻片,细胞长满盖玻片的90%时开始干预,分为4组进行干预：正常对照组：培养的平滑肌细胞未用阿托伐他汀干预;阿托伐他汀0.1μmol/L组：用浓度为0.1μmol/L的阿托伐他汀干预培养的平滑肌细胞;阿托伐他汀1.0μmol/L组：用浓度为1.0 μmol/L的阿托伐他汀干预培养的平滑肌细胞;阿托伐他汀10.0 μmol/L组：用浓度为10.0μmol/L的阿托伐他汀干预培养的平滑肌细胞.②分别于干预后6,12,24,48,72 h采用Hoechst 33258荧光染色观察血管平滑肌细胞凋亡情况：用免疫组化法检测血管平滑肌细胞凋亡抑制因子Survivin蛋白表达情况.③组间差异比较采用t检验.结果：①荧光染色检测血管平滑肌细胞凋亡结果显示,阿托伐他汀干预培养的大鼠血管平平滑肌细胞后,随干预时间延长和用药浓度增加,平滑肌细胞凋亡增加.阿托伐他汀干预72 h后,血管平滑肌细胞凋亡率：阿托伐他汀0.1,1.0,10.0 μmol/L组明显高于正常对照组（11.1%,27.2%,50.5%,3.8%,P＜0.01）,各组间两两比较差异明显（P＜0.01）.②培养的血管平滑肌细胞Survivin因子表达情况：阿托伐他汀干预24 h,血管平滑肌细胞凋亡抑制因子Survivin蛋白表达下降,干预48 h～72 h,血管平滑肌细胞Survivin因子未见表达.结论：①阿托伐他汀可诱导血管平滑肌细胞凋亡,其凋亡率呈时间和剂量依赖性.②阿托伐他汀致血管平滑肌细胞凋亡的作用可能与其下调凋亡抑制因子Survivin蛋白的表达有关.     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

高强度聚焦超声抗大鼠早孕的实验研究

目的探讨高强度超声聚焦(HIFU)抗大鼠早孕的有效剂量及可能机理。方法应用HIFU以14、12、10、8及6W/cm25种不同声强辐照孕8d大鼠左侧子宫角胚胎着床点,以右侧为对照。孕15d观察计算胚胎死亡率。同时用TUNEL染色检测子宫蜕膜细胞凋亡率。结果5种声强致大鼠胚胎死亡率与对照侧有显著差异(P<0.05)。声强≥10W/cm2与<10W/cm2胚胎死亡率有显著差异(P<0.01)。辐照侧蜕膜细胞凋亡指数与对照侧差异明显(P<0.05)。结论HIFU对大鼠胚胎完全性致死的剂量阈值为10W/cm2×90s。蜕膜细胞凋亡参与了HIFU抗大鼠早孕的过程。