低频超声对大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的作用

目的观察低频超声波对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMCs）凋亡的影响。方法42.6kHz超声辐照大鼠主动脉平滑肌细胞,台盼蓝染色分析辐照后即刻细胞存活率,流式细胞仪观察24小时后细胞凋亡。结果低频超声辐照可以诱导培养的VSMCs凋亡,该作用在50秒内随辐照时间的增加有增加的趋势。结论低频超声在无明显杀伤细胞的情况下可在短时间内诱导培养的VSMCs凋亡,提示低频超声是一种潜在的治疗PCI术后再狭窄的手段。     

野生型p53基因转移对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的：血管平均滑肌细胞的凋亡在球囊损伤后３０分钟内即已经开始，用基因转移的方法加速这一经过是控制再狭窄的途径之一。选择野生型ｐ５３作为目的基因，观察其对血管平滑骨细胞生长及凋亡的影响。方法：构建了野生型ｐ５３基因重组反转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ｐ５３。重组载体转染培养的大鼠主动脉增滑肌细胞，测定转染效率和ｐ５３基因的表达，用细胞存活曲线、流式细胞仪和ＤＮＡ “ｌａｄｄｅｒ”法检测了细胞生长和凋亡状况     

氧化低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞早期凋亡的影响

目的：观察低密度脂蛋白(ox—LDL)对培养血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响，探讨ox—LDL致VSMC调亡的相关机制。方法：体外培养Wistar大鼠VSMC并确认细胞指数生长期，用苔盼蓝拒染计数方法观察ox—LDL刺激VSMC对增殖的影响，流式细胞分析检测ox—LDL刺激VSMC凋亡以及COx—2抑制剂NS—398对凋亡的影响。结果：体外培养的VSMC正常生长后，用35mg儿和50mg／Lox—LDL可使培养VSMC的生长期提前到12—24h，表现出明显细胞增殖；NS—398干预ox—LDL组VSMC增殖受到减弱。流式细胞分析ox—LDL组VSMC早期凋亡率较对照组明显增加，而NS—398、ox—LDL刺激VSMC凋亡阳性率亦较对照组明显增加。结论：ox—LDL刺激可使培养VSMC表现明显细胞增殖，虽NS—398可减弱VSMC的增殖，但却协同ox—LDL导致凋亡作用的增强。     

氧自由基与血管平滑肌细胞凋亡

细胞凋亡(apoptosis)是1972年由Kerr[1]等提出的一个有别于细胞坏死(necrosis)的概念.Kerr等认为,细胞凋亡是生物体细胞普遍存在的生理性死亡过程,它在调节多细胞生物细胞群数量上起着和有机分裂互补的作用.细胞凋亡是细胞自控的程序化死亡过程,特定的诱发因素通过一系列信号转导途径启动细胞内的基因凋亡程序,产生细胞凋亡.尽管细胞凋亡的形态学特征高度恒定,但不同组织细胞的凋亡规律各具特异性.血管平滑肌细胞(vsmc)凋亡在动脉粥样硬化(AS),经皮冠状动脉成形术后再狭窄(RS)中的作用越来越受到重视,但其发生的机制和影响因素目前尚不是很清楚.本文就近年关于氧自由基对vsmc凋亡的影响规律及相关的信号转导机制作一综述.     

低频超声辐照联合微泡对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察低频超声辐照联合微泡对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法联合不同浓度的SonoVue(0、0.5×106、1.0×106、1.5×106、2.0×106/mL),使用42.6kHz超声分别辐照大鼠主动脉平滑肌细胞10s、20s、30s,空白对照组不作任何处理。台盼蓝染色分析辐照后即刻细胞存活率,流氏细胞仪观察辐照后24h细胞凋亡率。结果细胞的死亡和凋亡与微泡浓度及辐照时间相关。当超声波在微泡浓度达到或超过0.5×106/mL,联合辐照30s,以及微泡浓度达到2.0×106/mL,联合辐照10s、20s时,细胞大量死亡。在超声辐照10s时,辐照后24h细胞凋亡率随微泡浓度的增加而增加,但在微泡浓度低于1.0×106/mL时,细胞即刻存活率并无显著减少。在超声辐照20s时,细胞即刻存活率随微泡浓度的增加而减少,辐照后24h细胞凋亡率在微泡浓度为0.5×106/mL、1.0×106/mL、1.5×106/mL时差异无统计学意义。结论在一定空化强度范围内,低频超声辐照后24h细胞凋亡率随强度增加而增加,但超过一定程度,则无法增加细胞凋亡率,只会导致细胞死亡。低频超声辐照联合微泡的空化作用可在短时间内诱导体外培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的：采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞，并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法：实验于2004—02／08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只，体质量150—180g，无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm&;#215;1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中，组织块间距0．5cm，保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，发现漂起的组织块及时清理，于37℃孵箱内放置1．5h左右使组织块与壁贴附后，缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d，待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线，观察各生长时期的变化，并评估其培养方法的优点。结果：30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点：贴块方便，直接一次性贴壁使污染机会少，随组织块生长随时清理漂起的组织块，可减少对其他组织块的毒性作用，并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞：光镜观察形态多样，大小略有差异，胞体较小，胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞：光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向平行排列，有密区，具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色，所有细胞均染色，呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线：血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形，传代后第1天细胞数有所减少，经过2d潜伏适应期后进入对数生长期，持续两三天进入平台期。结论：组织块贴壁法培养技术具有操作简便，污染机会少，有足够细胞生长空间的优点，经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征，免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期，持续两三天进入平台期，可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。     

tMfn2基因诱导血管平滑肌细胞的凋亡

背景:线粒体融合素2蛋白,主要通过磷脂酰肌醇3激酶,蛋白激酶B诱导血管平滑肌细胞凋亡.去除穿膜区序列的线粒体融合素2蛋白,相对分子质量减小41%,诱导凋亡作用可能更强.目的:观察比较去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.设计、时间及地点:基因水平的对比观察实验.于2008-01/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心实验室完成.材料:大鼠血管平滑肌细胞及携带半乳糖甘酶基因、携带线粒体融合素2基因和携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒均由陈光慧教授惠赠.方法:将大鼠血管平滑肌细胞传代培养3～10代后随机分为4组,①空白对照组:不加干预.②携带半乳糖甘酶基因的对照组:感染携带半乳糖甘酶基因的重组腺病毒.③携带线粒体融合素2基因的实验组:感染携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒.④携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的实验组:感染携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒.主要观察指标:①重组腺病毒感染血管平滑肌细胞24 h后观察完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因的表达情况.②感染后24,48和72 h采用流式细胞术、酶联免疫吸附法观察细胞凋亡情况.③免疫印迹分析病毒感染血管平滑肌细胞24 h后磷酸化蛋白激酶B表达变化.结果:①感染后完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均有表达.②去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著增强,且呈时间依赖性(P<0.01).③两个实验组中磷酸化蛋白激酶B水平均明显降低,但去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因实验组更显著(P<0.01).结论:去除穿膜区序列的线粒体融合素基因2诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用更强,其机制与抑制蛋白激酶B磷酸化有关.     

激光照射诱导兔血管平滑肌细胞、内皮细胞凋亡的观察

目的 观察510.6nm激光照射后兔血管平滑肌细胞。内皮细胞凋亡率的变化规律,比较激光对两种细胞诱导凋亡的选择性作用,为临床应用激光防止再狭窄提供实验依据。方法 用照射剂量分别为100 mW/cm~2×500 s,100 mW/cm~2×1 000 s,150 mW/cm~2×1 000 s,200 mW/cm~2×500 s和200 mW/cm~2×1 000 s的铜蒸气激光照射兔腹主动脉,用 DNA末端标记法(TUNE)检测血管平滑肌细胞、内皮细胞的凋亡率。结果 经激光照射后,各激光组血管平滑肌细胞凋亡率分别为 21.2％,24.5％,30.8％,37.3％和 34.5％,对照组为3.4％,各激光组与对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05);各激光组内皮细胞凋亡率分别为1.0％,2.0％,2.0％,2.5％和3.1％,对照组为2.6％,各激光组与对照组间差异均无显著性意义(P>0.05)。结论 功率密度 100mW/cm~2以上的激光照射,可诱导兔在体血管平滑肌细胞凋亡,且凋亡率高,同等剂量的激光照射对内皮细胞的凋亡率无明显影响。     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础.因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题.组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胸作为血管组织工程种子细胞来源.     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础。因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题。组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胞作为血管组织工程种子细胞来源。     

整合素受体信号在血管平滑肌细胞增殖及迁移中作用机制研究进展

肺血管重构是肺动脉高压的病理学特征,血管重构中肺血管平滑肌细胞增殖、迁移是当今心血管领域的研究热点。近年来,发现整合素与细胞外基质的相互特异性作用导致许多细胞内结构性和调节性因子的聚集和传递细胞信号,参与调节细胞骨架的组装和解聚,调节肌动蛋白纤维丝的稳定和更新,在细胞表型的转换中也起着重要作用。因此,探讨整合素受体信号在血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用机制对于寻找干预肺血管重构的新途径具有重要意义。     

罗格列酮对体外培养大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及GW9662的干预作用

[目的]观察罗格列酮时血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响及探讨其可能机制.[方法]采用罗格列酮处理及处理前GW9662干预体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(AVSMCs),用流式细胞学法检测细胞凋亡率,原位凋亡检测法(TUNEL)检测细胞凋亡.[结果]罗格列酮对大鼠VSMCs凋亡诱导存在时阃依赖和浓度依赖:随着罗格列酮诱导时间的增加,细胞凋亡率逐渐增加,24h细胞凋亡率最高,超过24 h凋亡率没有继续增加;随着罗格列酮浓度的增加,细胞凋亡率运浙增加,100 μmol/L时细胞凋亡率最高,超过100 μmol/L细胞凋亡率不再增加.并且GW9662可逆转罗格列酮对AVSMCs凋亡的诱导.[结论]罗格列酮可能通过与PPAR-r结合并使PPAR-r激活诱导AVSMCs凋亡.     

诊断超声对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的研究

目的 检测诊断超声不同时间照身后对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响。方法 应用ＨＰ８５００彩色多普勒诊断仪（探头频率７．５ＭＨｚ,超声输出功率６．８Ｗ,空间平均时间平均声强（Ｉｓａｔａ）３．４ｍＷ／ｃｍ＾２）固定特续照射大鼠睾丸组织,分为５分钟组、１０分钟组、２０分钟组,３０分钟组和空照组。照射后２４小时取睾丸,应用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（ＴＵＮＥＬ）技术检测上述各组凋亡细胞。结果 超声持续照射５     

超声辐照联合超声造影剂介导的HSV-TK/GCV体外杀伤血管内皮细胞

目的探讨采用超声辐照联合超声造影剂介导含血管内皮生长因子受体-胸腺激酶(KDR-TK)基因的真核表达质粒载体转染血管内皮细胞的有效性,以及调控单纯疱疹病毒I型的胸腺激酶(HSV-TK)在血管内皮细胞中特异性杀伤作用。方法基因重组构建真核表达质粒载体pEGFP-KDR-TK,采用超声辐照联合超声造影剂SonoVue介导方式转染血管内皮细胞,MTT检测更昔洛韦(GCV)对KDR-TK/VEC(VEC)、原代人脐因管内皮细胞(HUVEC)、人肝癌细胞株(HepG2)的杀伤作用。结果GCV浓度为1、10、50和100μg/ml时,KDR-TK/VEC和HUVEC细胞抑制率分别为14.7%±11.0%vs5.2%±3.3%,P=0.412;44.9%±24.6%vs13.2%±1.7%,P=0.010;68.8%±7.0%vs26.2%±9.3%,P=0.001和73.2%±32.8%vs38.8%±16.8%,P=0.006。而HepG2细胞抑制率仅为6.1%±5.1%,9.4%±1.9%,13.2%±0.4%和14.7%±6.9%,与前两者比较,P均<0.05。结论超声辐照联合SonVue能有效地介导含KDR-TK真核表达质粒转染血管内皮细胞,可调控HSV-TK/GCV对血管内皮细胞的特异性杀伤作用。     

细胞外基质对血管平滑肌细胞桩蛋白和纽蛋白表达的影响

【目的】探讨细胞外基质（extracellular matrix,ECM）对体外培养的血管平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMCs）黏着斑（focal adhesions,FAs）分子桩蛋白（paxillin）和纽蛋白（vinculin）表达的影响。【方法】将第4～6代大鼠主动脉SMCs分别种植在涂有纤维连接蛋白（fibronectin,FN）或层黏连蛋白（laminin,LN）的盖玻片上或种植在基质胶内进行培养。采用共聚焦免疫荧光技术检测paxillin和vinculin的表达,并通过FAs分子paxillin／F-aetin和vineulin／F-actin的双重荧光染色显示。【结果】种植在FN上的vinculin表达最低,LN次之,而在Matrigel胶中表达最高;在FN上vinculin在胞质分布较多,在FA＇s较少;而生长在LN基质上和基质胶中vincu1in较多定位在FAs,在胞质分布较少。Vinculin的荧光强度在FN、LN及基质胶中分别为（64．72±7．18）AU／μm2,（89．82±5．11）AU／μm2,（117．19土16．99）AU／μm2,依次增高,且组间比较有统计学意义（P〈0．05）。种植在FN上的paxillin最高,LN上次之,而Matrigel胶中表达最低;基质胶中paxillin主要分布于FAs,而FN上的除分布于FAs外,在胞浆的表达水平也较高。Paxillin的荧光强度在FN、LN及基质胶中分别为（129．87±10．22）AU／μm2、（86．59±9．90）AU／μm2、（56．32±7.54）AU／μm2,依次降低,且组间比较有统计学意义（P〈0．05）。【结论】不同的ECM成分对FAs分子的表达有影响：FN上调paxillin的表达,下调vinculin的表达;而LN和基质胶上调vinculin的表达,下调paxillin的表达。     

缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡及检测方法研究

为探讨缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡情况，并用不同方法检测，将体外培养的不同方法检测，将体外培养的新生大鼠心肌细胞置于95%氮气及5%二氧化碳孵箱中一定时间造成缺氧损伤的心肌细胞模型，分别用HE染色，电镜，TUNEL法，流式细胞仪技术检测凋亡发生的情况，结果：均观察到缺氧诱导的心肌细胞凋亡，认为缺氧一定时间可以诱导体外培养的心肌细胞凋亡；检测心肌细胞凋亡的方法，需结合形态学及定量方法全面分析。     

腺病毒介导白细胞介素-10基因转染抑制血管平滑肌细胞的增殖及机制

目的：观察白细胞介素（interleukin，IL-10基因转染对血管平滑肌细胞增殖的影响，初步研究其相关机制。方法：不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的IL-10重组腺病毒（Ad／IL-10）转染原代培养的人脐带动脉平滑肌细胞（HUASMcs），用酶联免疫吸附试验检测培养上清中IL-10的表达，噻唑蓝法测定吸光度值（OD570值），绘制细胞生长曲线，流式细胞术分析细胞周期、细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链反应检测p21的表达。结果：MOI=100时培养上清中IL-10含量最高，为5．746ng／ml；转染72h、96h，MOI为100、150、200组与MOI为10、20组及空白对照组比较，显著抑制HUASMCs的增殖（P〈0．01）；与空白及空载体转染对照组比较，MOI100的Ad／IL-10转染组的Gn-1期细胞数、凋亡细胞的平均百分数均显著增加（P〈0．01），p21基因表达的拷贝数较低。结论：MOI为100的Ad／IL-10可有效抑制HUASMCs的增殖，此作用与细胞周期阻滞和凋亡有关，为ID-10基因转染治疗血管内膜增生提供了理论依据。     

CNP拮抗5-HT诱导的主动脉血管平滑肌细胞收缩作用的研究

【目的】探讨C-型利钠肽（C-type natriuretic peptide ,CNP）对5-羟色胺（5-hydroxytryptamine ,5-H T ）诱导的主动脉血管平滑肌细胞收缩的拮抗作用及其机制。【方法】主动脉血管平滑肌A10细胞,采用不同的CNP浓度（10-5～10-9 M ）分别作用不同的时间（0 min ,5 min ,10 min ,15 min ,20 min ,30 min）后,采用酶联免疫吸附法（Elisa方法）检测环磷酸鸟苷（cGMP）的含量变化;Western blot 检测CNP刺激后,细胞中蛋白激酶α（PKGIα）和 PKGIβ的蛋白表达变化;共聚焦显微镜观察 CNP拮抗5-HT 诱导的细胞收缩情况。【结果】经过不同浓度的CNP刺激后,平滑肌细胞中cGMP的生成量明显增加,呈浓度依赖性,且在刺激一开始时（5 min） cGMP浓度即开始明显增加,到10 min左右达到高峰。另外,经CNP作用后,cGMP的下游分子cGM P依赖性蛋白激酶（GM P-PKG ）被活化,主要表现为PKGIα表达增加;采用PKG特异抑制剂干扰后, CNP对5-HT诱导的主动脉血管平滑肌细胞收缩的拮抗作用减弱。【结论】CNP可活化cGMP-PKGIa信号拮抗5-HT诱导的主动脉血管平滑肌细胞收缩,表明CNP可作为预防治疗动脉粥样硬化治疗的有效靶点。