穿膜肽增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率的机制研究

目的研究穿膜肽增强支链聚乙烯亚胺（BPEI）在CHO-K1细胞中的基因转染效率的机制。方法分别合成蜂毒肽（melittin）及其疏水核心区MT20,利用圆二色光谱（CD）分析其二级结构;通过溶血试验比较二者穿透细胞膜的能力;加入蜂毒肽和MT20前后,观察钙黄绿素（calcein）在HeLa细胞内的分布情况。分别将蜂毒肽或MT20与BPEI按一定比例混合,以荧光素酶（luciferase）为报告基因,检测荧光素酶在CHO-K1细胞中的转染效率;以MTT法检测基因转染后的细胞毒性。结果在模拟膜环境的甲醇溶液中,蜂毒肽和MT20都呈现一定的α-螺旋结构,比例分别为59.63%和35.67%,说明其二级结构与之穿膜功能相关;蜂毒肽只能在中性条件下穿透细胞膜导致红细胞溶血,而MT20在中性和酸性条件下都具有穿膜能力;加入蜂毒肽和MT20后能够促进钙黄绿素在MT20组中呈弥散分布,在蜂毒肽组中呈颗粒状分布并且在核仁内蓄积;MT20和蜂毒肽都能够增强BPEI在CHO-K1细胞中的基因转染效率,其中MT20的增强作用更强且细胞毒性较蜂毒肽以及单独使用BPEI和Lipofectamine 2000时要低。结论蜂毒肽的疏水核心区MT20通过增加PEI/DNA复合物颗粒从内含体逃逸并促进其进入细胞核而增加其基因转染效率,是一种低毒的基因转染增强剂,有可能在难以转染的细胞系中发挥重要作用。     

靶向载基因及穿膜肽超声造影剂转染缺氧人脐静脉内皮细胞的研究

目的 探讨P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂的制备及转染缺氧损伤型人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的可行性.方法 采用机械振荡法及碳二亚胺法制备P-选择素靶向载绿色荧光蛋白基因及穿膜肽超声造影剂,检测其形态分布、浓度、粒径,采用激光共聚焦显微镜观察基因和穿膜肽的分布,用荧光分光光度法计算基因及穿膜肽的包封率.体外培养HUVEC,用过氧化氢处理制备HUVEC缺氧模型,并分为靶向和非靶向载基因及穿膜肽造影剂组进行转染实验.用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,流式细胞仪检测转染率,并用SPSS 17.0统计软件进行t检验及直线相关分析.结果 制备的P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂平均粒径约(2.15±0.36) μm,计数为(1.58±0.23) ×107个/ml.激光共聚焦显微镜下观察到基因和穿膜肽均匀分布在造影剂壁上,基因和穿膜肽的包封率分别为28％[y=0.932x -0.09(r =0.993,P＜0.05)]和25％ [y =5.875x -0.81(r =0.987,P＜0.05)].转染24 h后,荧光显微镜下观察到靶向和非靶向载基因及穿膜肽造影剂组均有绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测靶向组和非靶向组平均转染率分别约为( 18.74±0.47)％和(15.34±0.22)％(t=10.923,P＜0.001).结论 P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂能够转染缺氧损伤的HUVEC,这为靶向基因投递提供了新的思路.     

自制流动转染体系提高逆转录病毒介导的基因导入效率的研究

逆转录病毒是最常用的基因治疗载体 ,但对人类细胞的基因导入率较低。本研究建立了一个流动转染体系 ,利用电动流速调节装置控制带有重组逆转录病毒的培养液 ,以一定速度缓慢流过生物半透膜 ,迫使病毒与在膜上生长的K5 6 2细胞充分接触 ,从而提高基因导入效率。经半固体培养NeoR基因 /G418抗性集落法测定 ,无须筛选 ,单次基因导入率达 80 % ,与常规静止转染法相比 ,差异十分显著 (P <0 .0 1)。该装置简便、高效 ,可广泛地应用于基因治疗的基础和临床。     

经导管动脉输送转铁蛋白增强p53基因转染效率的研究

目的 研究转铁蛋白(Tf)对p53基因转染效率的影响,并探讨介入技术与Tf联合应用对基因治疗肝癌的双重靶向作用.方法 应用pCMV-myc-p53质粒与阳离子脂质体LipofectAMINE复合物,转染3种肝癌细胞株LM6、Hep3B、YY以及正常肝细胞株L02,以不同浓度Tf(0、10、25、50及100 μg)介导转染,蛋白印迹法检测各细胞株中p53表达情况,并对Tf影响p53转染效率的关系进行分析.再建立兔VX2肝癌动物模型,经介入导管输注Tf-质粒-脂质体复合物,提取肿瘤组织蛋白,蛋白印迹法检测P53表达.结果 4种细胞应用p53-脂质体复合物以及不同浓度Tf转染后48 h的蛋白印迹法检测,发现Tf在10～100 μg可明显增强p53-脂质体的转染效率,且转染效率随Tf浓度增加而增强.动物模型组织提取蛋白检测结果,显示Tf明显增强P53蛋白表达.结论 Tf能增强脂质体-基因转染,介入技术与Tf联合双重靶向对肝癌的基因治疗具有相当的应用前景.     

逆转录病毒介导v-myc基因转染神经干细胞的实验研究

目的 体外通过逆转录病毒将v-myc基因转染从胎龄10～12周人工流产胚胎脑皮层分离的神经干细胞(NSCs)后，观察其生物学特性的改变。方法 分离、鉴定孕10-12周人工流产的人胚胎脑皮层来源的NSCs，并在体外培养增殖。使用构建了v-myc基因的逆转录病毒转染NSCs后，对其进行光镜及电镜观察、生长情况的测定、染色体分析以及裸鼠移植。结果 转染v-myc基因的NSCs仍然保持着未分化状态，能够自我更新以及具有多向分化潜能，并且生长速率明显加快，分裂增殖能力明显增强。然而这种细胞的染色体存在结构异常与数目异常，将其植入裸鼠皮下短期内能形成肿瘤。结论 转染v-myc基因的NSCs具有正常NSCs的基本特性，但同时也存在染色体异常与致瘤性，目前暂不适合于移植的研究及应用。     

NIS基因转染肿瘤细胞介导131I治疗

钠/碘同向转运体(NIS)是一种跨膜糖蛋白,具有主动运输碘的能力.NIS的异常与许多甲状腺疾病有关.将NIS基因转染到肿瘤细胞使其表达NIS并摄取131I已获成功,但131I在细胞或病灶内停留的时间很短,达不到治疗剂量,故延长131I的有效半衰期和提高NIS转染率是今后研究的方向.     

纳米粒子介导血管内皮生长因子基因转染的实验研究

目的 观察纳米粒子携带血管内皮生长因子（VEGFl65）基因转染的可行性。方法 应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PL-GA）和聚乙烯醇（PVA）包载VEGFl65基因质粒,制备纳米级粒子混合物,检测其载药量、体外释放情况及粒径;培养心肌细胞,应用RT-PCR及ELISA方法观察纳米级粒子混合物为真核细胞传递基因的可行性;将纳米粒子悬浮液注射至活体家兔心肌组织内,96h后电镜观察其向心肌组织内传递基因的可行性。结果 制备的纳米粒子载药量为1．87％,粒径为25～300nm;RT-PCR和ELISA结果提示纳米粒子可将目的基因转移至心肌细胞中;体内实验显示心肌细胞胞质内及胞核内可见大量被吞噬的纳米粒子。结论 纳米粒子可作为向心肌组织转运VEGF基因的载体。     

穿膜肽TAT的表达与活性的初步研究

目的：构建原核表达载体,获得纯化的融合蛋白TAT-GFP,以便于考查TAT的细胞定位及穿膜功能。方法：将TAT基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因串联于原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导融合表达。分离纯化的融合蛋白与BHK-21细胞共孵育一定时间后,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的定位;同时以尾静脉注射方式进行小鼠给药实验,一定时间后麻醉,将主要器官组织取出、固定、冰冻切片,荧光显微镜下观察蛋白的分布情况。结果：DNA测序证明成功构建融合蛋白表达载体pET28a-tat-gfp。经诱导表达、纯化可获得纯度为85%以上的融合蛋白TAT-GFP。细胞实验表明,融合蛋白可迅速透过细胞膜并广泛分布于BHK-21细胞内,其中尤以细胞核内最多,而对照组GFP蛋白则不能穿透细胞膜入胞;动物实验中,给药2h后即可观察到TAT携带GFP到达小鼠的各主要器官和组织,甚至穿透血脑屏障分布于脑组织部分。结论：融合表达的穿膜肽TAT具有一定的携带生物分子（GFP）穿膜功能,本研究为深入了解TAT的性质及其未来应用奠定了一定的基础。     

NIS基因转染肿瘤细胞介导^131I治疗

钠/碘同向转运体（NIS）是一种跨膜糖蛋白，具有主动运输碘的能力，NIS的异常与许多甲状腺疾病有关，将NIS基因转染到肿瘤细胞使其表达NIS并摄取^131I在细胞或病灶内停留的时间很短，达不到治疗剂量，故延长^131I的有效半衰期和提高NIS转染率是今后研究的方向。     

逆转录病毒介导的对原代培养成年大鼠成肌细胞基因转染的研究

目的　探索成年大鼠成肌细胞的原代培养方法以及逆转录病毒对其的基因转染。方法　取成年SD大鼠的胸大肌 ,利用组织块法进行培养 ,并对培养细胞进行形态学研究和免疫细胞化学鉴定。以逆转录病毒为载体 ,将绿色荧光蛋白基因导入成年大鼠成肌细胞 ,利用倒置荧光显微镜及流式细胞仪对转染细胞进行观察。结果　采用组织块培养法 ,2周后成肌细胞的密度可达 10 7/ml,免疫细胞化学分析显示 90 %以上的细胞呈骨骼肌特异的myogenin抗体染色阳性。荧光显微镜和流式细胞仪检测发现eGFP基因可在成年大鼠成肌细胞中有效地表达 ,其转染效率约为 12 82 %。结论　利用组织块法成功培养成年大鼠原代成肌细胞 ,该方法实用性强 ,所得成肌细胞纯度高 ;逆转录病毒可介导成肌细胞的基因转导 ,为深入研究心肌梗死瘢痕中转基因成肌细胞自体移植奠定了基础。     

一种新的人源性穿膜肽

目的：观察一种新的人体蛋白结构域(Circadian locomoter output cycles kaput protein′s DNA-binding peptide，hCLOCK′s DNA_BIND)对细胞膜的穿透过程。方法：化学合成hCLOCK′s DNA_BIND，N端标记FITC荧光素，与培养的血管内皮细胞(ECV-304)和原代培养的神经胶质细胞孵化后，荧光显微镜下观察并进行荧光强度分析。结果：hCLOCK′s DNA_BIND能够有效通过细胞膜屏障，内化的量随孵化时间和肽段浓度的增加而增加，但温度的改变对其似乎没有影响。结论：hCLOCK′s DNA_BIND具有很强的内化作用，为研究药物安全透过细胞膜屏障的载体提供了有效途径。     

穿膜肽为载体的分子影像学应用研究进展

由于细胞膜的天然屏障作用,使得许多生物活性分子难以进入细胞发挥作用,这使人们在分子水平上诊治疾病受到了很大的限制.穿膜肽是1988年新发现蛋白转导肽,它可以高效地穿透细胞膜,并且在不依赖受体、能量、温度情况下可携带多种活性物质进入各种细胞.本文就穿膜肽的特点,在功能上转运蛋白、抗体、脂质体、基因以及作为分子成像新途径能结合荧光素,磁共振对比剂等进行细胞内显影作一个综述介绍.     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

目的：构建神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因转染的施万细胞。方法：NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(Schwann cell,SCs)。用免疫组化和ELISA方法,分别检测NT-3基因转染SCs的NT-3表达及培养液中NT-3的含量。结果：实验中获得得AdvNT-3中外源基因序列与大鼠NT-3的DNA序列完全一致,与未基因转染SCs相比,NT-3基因转染SCs的NT-3阳性增强,培养液中NT-3含量增高。     

hNIS基因的靶向性转染介导肝癌131I治疗

目的探讨鼠白蛋白基因启动子／增强子（mAlb）调控下人钠／碘同向转运体（hNIS）基因的组织特异性表达介导^131 I治疗肝癌的可行性。方法构建mAlb调控下萤光素酶表达载体和mAlb引导下hNIS/潮酶素共表达的重组逆转录病毒载体，后者用脂质体法转染包装细胞获取重组逆转录病毒颗粒感染鼠肝癌细胞MH3924A，建立稳定表达细胞系，并在体内和体外水平评价重组肝癌细胞对^125 I的摄取和流出，以及”。I对转染后肝癌细胞的杀伤作用及在移植瘤模型中的生物分布。结果体外培养条件下，hNIS基因稳定转染细胞系摄取^125 I高出野生型肝癌细胞240倍，该摄取过程可被Na^＋／K^＋-ATP酶抑制剂哇巴因（Ouabain）和NIS特异性阻断剂NaCIO4阻断。在含3．7MBq/ml^131 I的培养液中培养7h后，重组肝癌细胞和野生型肝癌细胞存活率分别下降了86％和8％。静脉注射^131I后，重组肝癌细胞移植瘤摄取量较对照高出19．2倍，静脉注射治疗剂量的^131 I后重组肝癌细胞移植瘤的生长明显受抑制。结论证实mAlb引导下hNIS基因的组织特异性表达介导^131I治疗肝癌的可能性，但疗效有待进一步提高。     

重组腺相关病毒介导癌胚抗原基因转染树突细胞的抗肿瘤作用研究

目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原(CEA)基因转染DC对结直肠癌的治疗作用.方法 构建rAAV/CEA质粒,制备病毒.采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC前体细胞,经rAAV/CEA转染DC后,采用PCR、Southern blot、流式细胞仪测定DC中CEA的表达,并检测rAAV/CEA的染色体整合情况及转染效率.加入GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导DC前体细胞至成熟DC.将成熟DC和T淋巴细胞混合,加入IL-2和IL-7培养,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL).采用体外51铬(51Cr)释放实验测定CTL对恶性肿瘤细胞的杀伤作用,3H掺入法检测rAAV/CEA转染DC对被激活T淋巴细胞增殖能力的影响.结果 rAAV成功介导了CEA基因转染DC,且在DC内高表达,超过90%的DC前体细胞表达CEA蛋白,且rAAV/CEA病毒基因成功地整合入DC基因组内.rAAV/CEA转染的DC可以诱导特异性CTL,有效地识别并杀伤CEA阳性的结直肠癌细胞株LoVo,并且具有MHC Ⅰ类限制性,而对CEA阴性的肿瘤细胞无杀伤作用.结论 以rAAV/CEA转染DC疫苗能够诱导抗肿瘤活性,为以人CEA作为靶抗原的结直肠癌的基因治疗奠定了基础.     

低强度激光对脂质体介导的心肌细胞基因转染的影响

目的观察低强度激光对脂质体介导的心肌细胞基因转染的影响.方法采用阳离子脂质体Lipofectamin介导外源性Lac-Z基因转染体外培养的大鼠心肌细胞,在基因转染过程中给予低强度激光照射,激光波长510.6nm和627.8nm,功率密度为1、5、10mW/cm2,照射时间为10、20min,调节能量密度分别为0.6、1.2、3、6、12J/cm2.激光照射于基因转染后即刻进行,同时设对照组1为转染不照射,对照组2为不转染不照射.于转染后48h用邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(O-nitrophenyl-D-galactopyra-noside,ONPG)检测细胞内Lac-Z基因表达产物β-半乳糖苷酶(galactosidase)的产量.结果所有照射剂量均能显著提高实验组心肌细胞β-半乳糖苷酶的产量,其中以510.6nm、1.2J/cm2组的效应最明显,其光密度(opticaldensity,OD)值较转染未照射组提高了15倍(0.718±0.088/0.048±0.008,P＜0.01);其余各组效应较弱,其OD值只提高了1.75～3.77倍(P＜0.05).结论低强度激光能促进脂质体介导的心肌细胞的基因转染,这一作用与低强度激光波长及能量密度有密切关系.     

重组腺病毒介导mIL-12 基因转染的 EL-4细胞生物学特性的研究

目的：观察 ｍ Ｉ Ｌ１２ 基因转染的小鼠 Ｅ Ｌ４ 细胞（ Ｃ５７ Ｂ Ｌ／６ 小鼠 Ｔ 淋巴瘤细胞株）体外生物学特性的改变。方法：阳离子脂质体协同 Ｉ Ｌ１２ 重组腺病毒感染 Ｅ Ｌ４ 细胞。结果及结论：基因转染的 Ｅ Ｌ４ 细胞有 ｍ Ｉ Ｌ１２ 的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达,培养上清中可以检测到 ｍ Ｉ Ｌ１２ 的生物学活性。与野生型 Ｅ Ｌ４ 细胞相比,ｍ Ｉ Ｌ１２ 重组腺病毒感染的 Ｅ Ｌ４ 细胞形态及体外增殖能力无明显改变, 转染细胞的成瘤性降低。此外,研究结果还表明,阳离子脂质体能显著提高腺病毒的感染效率。     

腺病毒介导的hVEGF基因转染细胞修复大鼠放射性皮肤溃疡的效果研究

目的 评价转染人血管内皮生长因子165(hVEGF 165)重组腺病毒载体的成纤维细胞体外表达状态及转染细胞修复放射性皮肤溃疡的效果。方法 构建hVEGF165基因过表达重组腺病毒载体,转染大鼠原代成纤维细胞,通过荧光定量PCR、免疫细胞化学和Western blot观察hVEGF165体外过表达状态;清洁级SD雄性大鼠24只,50 Gy γ射线局部照射,照后7 d于受照局部注射转染hVEGF165细胞,通过荧光定量PCR,分析转染基因在注射部位的表达状况,外观观察和组织学观察动物体内转基因细胞对放射性皮肤溃疡愈合效果的影响。结果 hVEGF转染组细胞体外实验中hVEGFmRNA表达显著上调,约为空转染组的88 373倍,胞质中出现hVEGF蛋白强阳性表达,且于相对分子质量23 000附近出现VEGF蛋白的特异性条带;受照后约2周局部出现溃疡,hVEGF转染组平均溃疡面积为40.2 mm²,比空转染对照组减少57%,愈合时间缩短约6 d,处理后3 d、1周皮肤组织中hVEGF mRNA相对表达量分别为空转染组的5.15和4.15倍(t=3.385、3.220,P<0.05)。结论 转染hVEGF165重组腺病毒载体的大鼠成纤维细胞能够在体外过量表达VEGF,且该转染细胞注射体内能够缩短放射性皮肤溃疡的愈合时间,增强损伤的愈合效果。     

hNIS基因转染介导Hela细胞移植瘤放射性核素显像和治疗的实验研究

Objective To explore the feasibility of imaging and treatment of cervical cancer xenograft model using 131I mediated by hNIS gene transfection. Methods The cervical cancer xenograft models were established with Hela-NIS( +) cells and Hela cells, respectively. Five Hela-NIS( +) xenograft models and five Hela xenograft models were dynamically imaged at 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 and 20 h postinjection of 131I(7.4 MBq). Five Hela-NIS( +) xenograft models were imaged at 0. 5,1,2,4,8,16, 20 and 25 h postinjection of 99TcmO4-(11.1 MBq). Twenty Hela-NIS( +) cervical cancer xenograft models were randomly divided into four groups: Three 131I treating groups and one control group. The therapeutic effects of 131I at threelevels (74,111,148 MBq) were investigated following intraperitoneal injection. Results Hela-NIS( +)human cervical cancer xenografts were established successfully in nude mice. The Hela-NIS( +) xenografts significantly accumulated radioactivity after intraperitoneal injection of 131I, and the radioactivity was persistently present until 20 h postinjection, but Hela xenografts had no radioactive accumulation. The T/B value of the Hela-NIS( +) xenografts reached 17.34 at 8 h postinjection. The imaging with 99TcmO4- showed that the radioactivity was persistently present in Hela-NIS( +) xenografts for almost 25 h. The Hela-NIS( +)xenografts shrinked after 131I treatment. The inhibition ratios of tumor growth in 111 MBq and 148 MBq groups were both significantly higher than that of 74 MBq group (t: 2.74-5.75, P ＜0.05). Conclusions Hela-NIS( +) cervical cancer xenografts in nude mice could persistently accumulate 131I and 99TcmO4- and could be treated successfully with 131 I. 131 I treatment mediated by hNIS gene transfection could be a promising cancer treatment method.